Método para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra.

Un método para la detección cromogénica de dos moléculas diana en una sola muestra de tejido que consiste en:

poner en contacto la muestra de tejido con una primera fracción de unión específica que se une específicamente a una primera molécula diana;

detectar la primera molécula diana en la muestra de tejido depositando un producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones, en donde las deposición cromogénica consiste en hacer reaccionar 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) con un catalizador para formar directa o indirectamente el producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones;

poner en contacto la muestra de tejido con una segunda fracción de unión específica marcada con el hapteno que se une específicamente a una segunda molécula diana, en donde el hapteno de la segunda fracción de unión específica marcada con el hapteno es dinitrofenol;

tratar la muestra de tejido con una solución que contiene un compuesto aromático soluble, rico en electrones, que contiene naftol fosfato, se realiza antes o al tiempo que se pone en contacto la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol con la muestra de tejido.

detectar la segunda molécula diana a base de depositar un segundo producto cromógeno insoluble que pueda distinguirse del compuesto aromático insoluble, rico en electrones depositado para detectar la primera molécula diana, en donde el tratamiento de la muestra de tejido con la solución que contiene el compuesto aromático soluble, rico en electrones, reduce la tinción de fondo resultante de la unión no específica de la fracción de unión específica marcada con dinitrofenol al compuesto insoluble rico en electrones depositado cerca de la primera molécula diana.

Método para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra Campo [002] Esta invención se refiere a la inmunohistoquímica (IHC) y a la hibridación in situ (ISH) , y, específicamente, a realizaciones de un método para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana 5 en una sola muestra.

Antecedentes [003] La inmunohistoquímica (IHC) utiliza agentes de unión específica, como anticuerpos, para la detección de un antígeno de interés que puede encontrarse presente en una muestra de tejido. La IHC se utiliza ampliamente en aplicaciones clínicas y de diagnóstico, como el diagnóstico de estados o condiciones 10 patológicas particulares. Por ejemplo, algunos tipos particulares de cáncer pueden diagnosticarse en base a la presencia de una molécula marcadora particular en una muestra obtenida de un sujeto. La IHC también se utiliza ampliamente en la investigación básica para comprender la distribución y localización de biomarcadores en diferentes tejidos.

[004] Las muestras biológicas también pueden examinarse mediante técnicas de hibridación in situ (ISH) , como 15 la hibridación in situ (SISH) con plata, la hibridación in situ cromogénica (CISH) e hibridación in situ fluorescente (FISH) , denominadas colectivamente ISH. La ISH se diferencia de la IHC, en que la ISH detecta ácidos nucleicos en secciones de tejidos mientras que la IHC detecta proteínas.

[005] A medida que los métodos de IHC e ISH van adquiriendo cada vez más importancia en el terreno clínico y de la investigación, también lo va haciendo la capacidad de detectar múltiples dianas a la vez, como la doble 20 detección de una secuencia de ácido nucleico y una proteína o múltiples proteínas o ácidos nucleicos en una sola muestra. Por ejemplo, un sistema de doble detección de genes/proteínas permitiría la detección de genes y proteínas en el mismo portaobjetos en un solo proceso automatizado en lugar de en dos procesos separados. No obstante, los sistemas de detección actuales no prevén convenientemente la detección de múltiples dianas, tal como la doble detección de genes/proteínas, en el mismo portaobjetos dado que los 25 métodos de IHC e ISH normalmente son incompatibles entre sí.

Resumen En la Patente WO 94/02830 A1 se presenta un proceso para el fenotipado y genotipado de una célula que incluye un paso que consiste en poner la célula en contacto con una sonda de ADN marcada.

En la Patente WO 98/02577 A1 se presenta un método para la detección conjunta de genes introducidos y sus 30 productos. En la Patente WO 00/20641 A1 se presentan métodos para el análisis de una muestra de tejido y kits para su uso en dichos métodos. En la Patente WO 2008/063378 A2 se presentan haptenos, conjugados de haptenos, composiciones y un método para su preparación y uso. Ambretti et. al. (2007) BR.J. Dermatol. 156, 38-44 presenta una evaluación de la presencia del virus del papiloma humano de tipo mucoso en melanomas malignos mediante la hibridación in situ fluorescente y la inmunohistoquímica quimioluminiscente combinadas. 35

[006] La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, establece métodos y kits para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra. Otras disposiciones de la presente invención abordan la tinción de fondo no específica que tiene lugar al realizar un método para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra de tejido. Así, la presente invención se refiere particularmente a cualquier proceso y/o composición capaz de facilitar la doble detección al tiempo que reduce 40 la tinción de fondo no específica. Esto se consigue a base de reducir o prevenir sustancialmente la unión no específica de un compuesto aromático deficiente en electrones (DNP) a un complejo cromógeno rico en electrones durante la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra. Los métodos aquí descritos pueden realizarse de manera automatizada o manual.

[007] En una realización de la invención, un método para la detección cromogénica de dos o más moléculas 45 diana en una sola muestra de tejido consiste en poner en contacto la muestra de tejido con una primera fracción de unión específica que se une específicamente a una primera molécula diana. En un ejemplo, la primera fracción de unión específica es un anticuerpo primario y la primera molécula diana es una proteína. Por ejemplo, el anticuerpo primario puede ser un anticuerpo que detecta una proteína asociada al cáncer, tal como un anticuerpo primario HER2/neu (o proteína HER2) , c-Myc, n-Myc, Ab1, proteína EGFR, TOP2A, Bc12, Bc16, 50 Rb1, p53 o c-Met.

[008] La realización particular de la invención para la detección cromogénica también consiste en detectar la primera molécula diana en la muestra de tejido a base de depositar un producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones, en o cerca del punto en el que la primera fracción de unión específica se une a la primera molécula diana. En un ejemplo, el compuesto aromático insoluble, rico en electrones es un colorante 55 azoico. En algunos ejemplos, la deposición de un producto cromógeno consiste en hacer reaccionar un sustrato con un catalizador para formar el compuesto aromático insoluble, rico en electrones. Por ejemplo, el catalizador puede ser una enzima, como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano. Además, el sustrato es diaminobenzidina (DAB) .

[009] Algunas realizaciones presentadas de un método de la invención para la detección cromogénica de dos o más moléculas en una sola muestra de tejido también pueden consistir en poner en contacto la muestra de 5 tejido con una segunda fracción de unión específica marcada con DNP que se une específicamente a una segunda molécula diana.

[010] Realizaciones de la invención incluyen el tratamiento de la muestra de tejido con una solución conteniendo un compuesto aromático soluble, rico en electrones, antes de poner o al mismo tiempo que la muestra de tejido se pone en contacto con una fracción de unión específica marcada con DNP. En un ejemplo 10 de la invención, el tratamiento de la muestra de tejido con la solución conteniendo un compuesto aromático soluble, rico en electrones, se realiza antes de poner en contacto la muestra de tejido con la segunda fracción de unión específica marcada con DNP. En otro ejemplo de la invención, el tratamiento de la muestra de tejido con la solución conteniendo un compuesto aromático soluble, rico en electrones, se realiza de forma concomitante con la puesta en contacto de la segunda fracción de unión específica marcada con DNP con la 15 muestra de tejido. En la invención, el compuesto aromático soluble, rico en electrones, que contiene naftol fosfato.

[011] Realizaciones de la invención para la detección cromogénica de dos o más moléculas también incluyen la detección de la segunda molécula diana a base de depositar un segundo producto cromógeno insoluble distinguible (por ejemplo, distinguible visualmente) del compuesto aromático insoluble, rico en electrones, 20 depositado para detectar la primera molécula diana. El tratamiento de la muestra de tejido con una solución conteniendo el compuesto aromático soluble, rico en electrones que incluye naftol fosfato reduce la tinción de fondo debido a la unión no específica de la fracción de unión específica marcada con DNP con el compuesto insoluble, rico en electrones, depositado cerca de la primera molécula diana.

[012] Por ejemplo, en la invención, la segunda fracción de unión específica, marcada con DNP puede ser una 25 sonda de ácido nucleico marcada con DNP, tal como una sonda de ADN marcada con DNP. En algunos ejemplos, la concentración de la sonda de ácido nucleico marcada con DNP es suficiente para prevenir o reducir la tinción de fondo que ocurre cuando la sonda de ácido nucleico marcada con DNP se une de manera no específica a un producto cromógeno asociado a una primera molécula diana. En algunos ejemplos, la concentración de la sonda marcada con DNP es superior a 1 y, normalmente, de 5 g/ml como mínimo. Por 30 ejemplo, la concentración de la sonda de ácido nucleico marcada con DNP varía de 10 g/ml a 15 g/ml.

[013] En un ejemplo de la invención, la primera molécula diana es una proteína y la segunda molécula diana es una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la primera molécula diana. La primera molécula diana y la segunda molécula diana pueden estar asociadas a un trastorno o enfermedad, incluido el cáncer, tal como una proteína HER2, proteína c-Myc, proteína n-Mye, proteína Ab1, proteína EGFR, proteína TOP2A, 35 proteína Bc12, proteína Bc16, proteína Rb1, proteína... [Seguir leyendo]

1. Un método para la detección cromogénica de dos moléculas diana en una sola muestra de tejido que consiste en:

poner en contacto la muestra de tejido con una primera fracción de unión específica que se une específicamente a una primera molécula diana; 5

detectar la primera molécula diana en la muestra de tejido depositando un producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones, en donde las deposición cromogénica consiste en hacer reaccionar 3, 3'-Diaminobenzidina (DAB) con un catalizador para formar directa o indirectamente el producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones;

poner en contacto la muestra de tejido con una segunda fracción de unión específica marcada con el 10 hapteno que se une específicamente a una segunda molécula diana, en donde el hapteno de la segunda fracción de unión específica marcada con el hapteno es dinitrofenol;

tratar la muestra de tejido con una solución que contiene un compuesto aromático soluble, rico en electrones, que contiene naftol fosfato, se realiza antes o al tiempo que se pone en contacto la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol con la muestra de tejido. 15

detectar la segunda molécula diana a base de depositar un segundo producto cromógeno insoluble que pueda distinguirse del compuesto aromático insoluble, rico en electrones depositado para detectar la primera molécula diana, en donde el tratamiento de la muestra de tejido con la solución que contiene el compuesto aromático soluble, rico en electrones, reduce la tinción de fondo resultante de la unión no específica de la fracción de unión específica marcada con dinitrofenol al compuesto insoluble rico en electrones depositado 20 cerca de la primera molécula diana.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la concentración de Naftol reduce la tinción de fondo resultante de la unión no específica de la fracción de unión específica marcada con el hapteno al compuesto insoluble rico en electrones depositado cerca de la primera molécula diana y varía de 1 miligramo por mililitro a 30 miligramos por mililitro. 25

3. El método de la reivindicación 2, en donde la concentración de Naftol varía de 1 miligramo por mililitro a 7 miligramos por mililitro.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol es una sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol es 30 una sonda de ADN.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la concentración de la sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol es de 5 mg/ml como mínimo.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la concentración de la sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol varía de 10 µg/ml a 15 µg/ml. 35

8. El método de la reivindicación 1, en donde la primera molécula diana es una proteína y la segunda molécula diana es una secuencia de ácido nucleico.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la primera molécula diana es una proteína y la segunda molécula diana es una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de la primera molécula diana.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la proteína es HER2/neu, c-Myc, n-Myc, Abl, proteína 40 EGFR, TOP2A, Bc12, Bc16, Rb1, p53 o c-Met.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la primera molécula diana y la segunda molécula diana son una primera proteína y una segunda proteína.

12. El método de la reivindicación 1, en donde la primera molécula diana y la segunda molécula diana son una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico. 45

13. El método de la reivindicación 1, en donde la segunda molécula diana es una secuencia de ácido nucleico.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ácido nucleico que codifica HER2, c-Myc, n-Myc, Abl, EGFR, TOP2A, Bc12, Bc16, Rb1, p53 y c-Met.

15. El método de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de la muestra de tejido con la solución que contiene un compuesto aromático soluble, rico en electrones y conteniendo naftol fosfato, consiste en tratar la muestra de tejido con la solución que contiene un compuesto aromático soluble, rico en electrones que contiene naftol fosfato antes de poner en contacto la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol con la muestra de tejido. 5

16. El método de la reivindicación 1, en donde el tratamiento de la muestra de tejido con la solución conteniendo un compuesto aromático soluble, rico en electrones, conteniendo naftol fosfato consiste en tratar la muestra de tejido con la solución que contiene un compuesto aromático soluble, rico en electrones que contiene naftol fosfato al mismo tiempo que se pone en contacto la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol con la muestra de tejido. 10

17. El método de la reivindicación 1, en donde la primera fracción de unión específica es un anticuerpo primario.

18. El método de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo primario se une a HER2, c-Myc, n-Myc, Abl, proteína EGFR, TOP2A, Bc12, Bc16, Rb1, p53 o péptidos c-MET.

19. El método de la reivindicación 1, en donde el catalizador es una enzima. 15

20. El método de la reivindicación 19, en donde la enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano.

21. El método de la reivindicación 1, en donde la detección de la primera molécula diana consiste en realizar la inmunohistoquímica (IHC) y la detección de la segunda molécula diana consiste en realizar la hibridación in situ (ISH) en donde la realización de la IHC consiste en detectar la primera molécula diana mediante un sistema de detección de cromógeno de fosfatasa alcalina-color rojo o un sistema de detección 20 cromógeno de peroxidasa de rábano-DAB y la realización de la ISH consiste en detectar la segunda molécula diana a través de un sistema de detección ISH a base de peroxidasa de rábano-plata o un sistema de detección a base de fosfatasa alcalina color rojo-plata.

22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en donde el método es automatizado y consiste particularmente en: 25

dispensar automáticamente un anticuerpo primario sobre una muestra de tejido bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo primario se una específicamente a una primera molécula diana que se encuentra dentro de la muestra de tejido;

detectar la primera molécula diana en la muestra de tejido con el anticuerpo primario por IHC;

dispensar automáticamente una sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol sobre la muestra de 30 tejido bajo condiciones suficientes para que la sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol se una específicamente a una segunda molécula diana;

tratar la muestra de tejido con una solución que contiene un compuesto aromático rico en electrones y conteniendo naftol fosfato antes de dispersar o al tiempo que se dispensa automáticamente la segunda sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol sobre la muestra de tejido; y 35

detectar la segunda molécula diana por hibridación in situ (ISH) , permitiendo así la doble detección de ácido nucleico y proteínas en la misma muestra de tejido en un solo proceso automatizado.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la ISH consiste en detectar el ácido nucleico diana por ISH con tinción de peroxidasa de rábano-plata o tinción con fosfatasa alcalina color rojo-plata.

24. El método de la reivindicación 23, en donde la IHC consiste en detectar la proteína diana mediante 40 un cromógeno de fosfatasa alcalina-color rojo o un cromógeno de peroxidasa de rábano-DAB.

25. Un kit para la detección cromogénica de dos o más moléculas diana en una sola muestra de tejido, que comprende una solución conteniendo 3, 3'-Diaminobenzidina (DAB) y un catalizador para formar, directa o indirectamente, un producto cromógeno aromático, insoluble, rico en electrones, a partir de DAB, una primera fracción de unión específica que se une específicamente a una primera molécula diana; una solución 45 conteniendo una segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol que se une específicamente a una segunda molécula diana; una solución conteniendo un compuesto aromático soluble, rico en electrones y conteniendo naftol fosfato, en donde la segunda fracción de unión específica marcada con dinitrofenol es una sonda de ácido nucleico marcada con DNP.

26. El kit de la reivindicación 25, en donde la solución conteniendo el compuesto aromático soluble, rico 50 en electrones, y conteniendo naftol fosfato contiene además la sonda de ácido nucleico marcada con dinitrofenol.