Método para la desparafinación de una muestra tisular a base de una microemulsión.

Procedimiento de retirada del medio impregnado en parafina de una muestra biológica impregnada en parafina que comprende:

poner en contacto la muestra biológica impregnada de parafina con una microemulsión desparafinante que comprende tensoactivo, solvente orgánico no polar y agua, en la que el tensoactivo es soluble tanto en agua como en el solvente orgánico no polar, transfiriendo la parafina a la microemulsión; y

Separar la microemulsión.

Método para la desparafinación de una muestra tisular a base de una microemulsión Campo técnico

Las invenciones aquí descritas se dirigen al campo general de la patología anatómica, y en particular a la preparación de muestras biológicas, especialmente secciones tisulares, para la posterior tinción con composiciones químicas, inmunohistoquímicas o a base de hibridación in situ. Los métodos de preparación de tejidos y las composiciones permiten una desparafinación innovadora y un intercambio de fluidos dentro de los tejidos, preparándolos para una tinción posterior o potencialmente simultánea.

Fundamento de la invención

El análisis de muestras tisulares biológicas es una valiosa herramienta diagnóstica utilizada por los patólogos para diagnosticar muchas enfermedades como el cáncer y las enfermedades infecciosas, así como por el investigador médico para obtener información acerca de la estructura celular.

Para obtener información de una muestra tisular biológica normalmente es necesario realizar una serie de operaciones preliminares para preparar la muestra para el análisis. Mientras que existen muchas variaciones de los procedimientos para preparar las muestras tisulares, estas variaciones se pueden considerar refinamientos para adaptar el proceso a tejidos individuales o porque una técnica en particular se adapta mejor a la hora de identificar una sustancia química específica o un marcador biológico en la muestra tisular. Sin embargo, las técnicas de preparación básicas son esencialmente las mismas. Las muestras de tejido biológico pueden derivar de tejidos sólidos como de una biopsia tisular o bien pueden derivar de preparados a base de líquido de las suspensiones celulares como de un estudio citológico (por ejemplo, prueba de Papanicolau), de la médula ósea o de una suspensión celular.

Normalmente dichos procedimientos pueden incluir el tratamiento del tejido mediante su fijación, deshidratación, infiltración e impregnación en cera de parafina; la colocación del tejido sobre un portaobjetos de vidrio y luego la tinción de la muestra; el etiquetado del tejido mediante la detección de diversos constituyentes; el análisis de las secciones tisulares por medio de un microscopio electrónico o bien el crecimiento de células en placas de cultivo.

Dependiendo del análisis o de las pruebas que se vayan a efectuar, una muestra puede someterse a una serie de etapas o pasos preliminares o bien tratamientos o procedimientos antes de estar lista para analizar su contenido. Normalmente los procedimientos son complejos y requieren tiempo, e implican varias etapas sucesivas donde se utilizan materiales caros y/o tóxicos.

Por ejemplo, una muestra de tejido típica puede someterse a un examen microscópico óptico de manera que se pueda determinar la relación de las diversas células, unas con otras, o bien se puedan destapar posibles anomalías. Por tanto, la muestra tisular debe ser una tira extremadamente fina de tejido de manera que la luz pueda ser transmitida a través de ella. El grosor medio de la muestra tisular o del corte (al que a menudo se conoce como "sección") es aproximadamente de 2 a 1 micrómetros (1 micrómetro = 1/1 de un milímetro). Normalmente, una muestra tisular está congelada o bien fijada a un material (un fijador), que no solamente mantiene la estructura celular sino que además interrumpe cualquier otra acción enzimática que pudiera dar lugar a la putrefacción o autólisis del tejido.

Después de la fijación la muestra tisular es deshidratada al retirar el agua de la muestra mediante el uso de fuertes concentraciones de alcohol miscible en agua, en particular etanol. Luego el alcohol es reemplazado por un material químico, normalmente un material no polar, que se mezcla con la cera de parafina o con alguna otra sustancia plástica impregnante que puede penetrar en la muestra tisular y darle una consistencia adecuada para la preparación de secciones finas sin que se produzca una desintegración o división. El proceso de retirar el agua o las soluciones acuosas, y sustituirla por un material no polar, como un disolvente orgánico no polar, se denomina "intercambio de solvente" porque implica la exposición secuencial del tejido a las soluciones de solvente de diversas proporciones de agua/alcohol/solvente orgánico no polar hasta que el agua del tejido es intercambiada por otro fluido (o en caso de tejido impregnado, una cera de parafina semisólida conocida frecuentemente como parafina). El intercambio de solvente se puede utilizar en otra dirección, es decir, es un proceso bidireccional; al igual que el proceso de retirada del agua y de su sustitución por un material no polar, y el proceso de retirada de material no polar y su sustitución por agua.

Luego se utiliza un micrótomo para realizar cortes finos de la muestra tisular impregnada de parafina. Los cortes pueden ser de 5 a 6 micrómetros de grosor mientras que el diámetro puede ser del orden de 5 a 2 mieras. Las secciones cortadas se sumergen en un baño de agua para ablandarlas. Luego la sección se coloca sobre un portaobjetos de vidrio que suele medir unos 2,5 por 8 centímetros (1x3 pulgadas).

Mediante el intercambio de solvente se retira luego la cera de parafina o el impregnante, por ejemplo, exponiendo la muestra a un solvente de parafina como el xileno, tolueno o limoneno, retirando el solvente mediante alcohol, y retirando el alcohol mediante mezclas secuenciales de alcohol/agua o bien reduciendo las concentraciones alcohólicas, hasta que eventualmente el tejido sea de nuevo infiltrado por agua o soluciones acuosas. La infiltración de la muestra por agua permite la tinción de los constituyentes celulares mediante colorantes químicos e inmunoquímicos. Este proceso se conoce como proceso de desparafinación.

En los últimos años han mejorado ciertas etapas del proceso de desparafinación. Los disolventes tóxicos de parafina como el xileno o el tolueno son ahora sustituibles por solventes orgánicos no polares menos tóxicos como el aceite de terpeno (por ej. AmeriClear Baxter Healthcare Diagnostics, McGaw Park, IL), los hidrocarburos isoparafínicos como el MicroClear de Micron Diagnostics of Fairfax, VA, y el histoleno, un eliminador de parafina que es 96% d- limoneno (Fronine Pty Ltd, Riverstone, New South Wales, Australia). Han aparecido también métodos automatizados nuevos. Por ejemplo, Ventana Medical Systems. La patente americana nr. 6544798 describe un método automatizado para eliminar cera de parafina de las secciones tisulares usando solamente agua caliente con tensoactivo. El proceso se basa en la división física de la parafina licuada del tejido teniendo en cuenta la inmiscibilidad de la parafina licuada y el agua caliente. El proceso se utiliza ampliamente en la serie BENCHMARK® de pigmentos de tejido automatizados. Un método afín basado en el agua y en un tensoactivo emulsionante se conoce de la patente americana nr. 6649368.

La patente americana 6632598(Zhang y cois.) describe métodos y composiciones para desparafinar el tejido impregnado de parafina. El método implica poner en contacto la muestra impregnada de cera con una composición que elimina la parafina para solubilizar la cera que impregna la muestra antes del análisis histoquímico. Las composiciones que eliminan la parafina incluyen específicamente un solvente orgánico solubilizante de la parafina elegido del grupo formado por hidrocarburos aromáticos, terpenos e hidrocarburos isoparafínicos, un solvente orgánico polar, y un tensoactivo para solubilizar la cera asociada a la muestra. Las composiciones pueden comprender además agua. Una ventaja citada de las composiciones es que no requieren xileno, tolueno o disolventes de parafina no deseables. Sin embargo, las composiciones reales requieren todas, grandes cantidades de solvente polar orgánico, habitualmente un alcohol miscible en agua.

Existe la necesidad de unos mejores procesos de preparación de los tejidos que no requieran sustancias químicas tóxicas o peligrosas, y métodos que reduzcan el tiempo y las etapas implicadas en el tratamiento de muestras tisulares para hacerlas aceptables para los procedimientos de tinción del tejido.

Finalidad de la invención

La invención se dirige a un procedimiento de eliminación de un medio impregnado en parafina de una muestra biológica impregnada en parafina, que consiste en poner en contacto la muestra biológica impregnada de parafina con un tensoactivo que consta de una microemulsión desparafinante, un solvente orgánico no polar y agua, donde el tensoactivo es soluble tanto en agua como en el solvente orgánico no polar. Se transfiere con ello la parafina a la microemulsión y se elimina la microemulsión. Es preferible que el tensoactivo sea soluble individualmente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de retirada del medio impregnado en parafina de una muestra biológica impregnada en parafina que comprende:

poner en contacto la muestra biológica impregnada de parafina con una microemulsión desparafinante que comprende tensoactivo, solvente orgánico no polar y agua, en la que el tensoactlvo es soluble tanto en agua como en el solvente orgánico no polar, transfiriendo la parafina a la microemulsión; y Separar la microemulsión.

2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el tensoactlvo es un tensoactivo no iónico

3. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el tensoactlvo se elige del grupo que consta esencialmente de alcoholes alquilo etoxllados y ácidos alqullcarboxilicos etoxllados.

4. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la retirada de la microemulsión implica su lavado.

5. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el tensoactivo tiene la fórmula estructural siguiente:

Ri-X-(CH2CH2)n-R2

donde Ri es un hidrocarburo alcano ramificado o lineal de cadena larga de C5 a C3; X es un grupo de enlace que comprende un éter, áster, carbonato, bencilo o sorbitol; n se encuentra entre 5 y 2 y R2 es un hidrógeno.

6. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el tensoactivo se elige del grupo compuesto por condensados de óxido de etileno de alcoholes grasos lineales o ramificados; polietilenglicol 4 laurato; y éter trldecano hexaetllengllcol.

7. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que dicho solvente orgánico no polar se elige del grupo formado por terpenos, alqullbencenos, solventes aromáticos, aceites de paraflna normales y aceites de parafina ramificados.

8. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que el solvente orgánico no polar comprende un fluido hidrocarbonado de parafina de cadena lineal C15.

9. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la microemulsión desparafinante tiene un porcentaje de agua frente a tensoactivo de :1 hasta 1:1 en peso.

1. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la microemulsión desparafinante tiene un porcentaje entre :1 y 1:1 en peso de agua frente a solvente orgánico no polar.

11. Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que la microemulsión desparafinante comprende un tensoactivo en un porcentaje en peso entre un 5% y un 9%, aceite en un porcentaje en peso entre un 5% y un 9% y agua en un porcentaje en peso entre un % y un 9%.