Método para electroforesis capilar de alta resolución a alta velocidad.

Una composición para separar analitos por electroforesis capilar que comprende:

un componente de cribado que comprende un polímero de acrilamida no reticulado que tiene un peso molecular medio ponderado mayor de 1.000.000 Daltons (Da) y menos de o igual a 3.000.000 Da; y

un componente de interacción con la superficie que comprende uno o más homopolímeros y copolímeros de acrilamida hidrófobos N-alquil-sustituidos de fórmula:

en donde R7 es -H o -CH3, R9 y R8 son independientemente -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, CH(CH3)2 o - CH2CONH2, y caracterizado por que z oscila entre aproximadamente 2.000 y 50.000, oscilando el peso molecular medio entre 200.000 Da y 5.000.000 Da,

en donde el componente de cribado y el componente de interacción con la superficie son diferentes;

en donde la composición tiene una viscosidad inferior a 1000 mPa·s a 25°C; y en donde la composición no comprende un gel de polímero reticulado.

Método para electroforesis capilar de alta resolución a alta velocidad Campo de la invención

Las invenciones se refieren a composiciones y elementos de electroforesis capilar para la separación de analitos por electroforesis capilar. Se proporcionan además kits para la separación de analitos por electroforesis capilar.

Antecedentes de la invención

La electroforesis capilar se ha aplicado extensamente como técnica analítica debido a varias ventajas técnicas: (i) los capilares tienen relaciones superficie a volumen elevadas que permiten una disipación de calor más eficiente que, a su vez, permiten utilizar campos eléctricos elevados para separaciones más rápidas; (ii) la técnica requiere volúmenes de muestra mínimos; (iii) se obtiene resolución superior de la mayoría de los analitos ; y (iv) la técnica es susceptible de automatización, véase, p. ej., Camilleri, editor, Capillary Electrophoresis: Theory and Practice (CRC Press, Boca Ratón, 1993); y Grossman et al., editores, Capillary Electrophoresis (Academic Press, San Diego, 1992). Debido a estas ventajas, ha habido gran interés en aplicar la electroforesis capilar a la separación de biomoléculas, sobre todo de ácidos nucleicos. La necesidad de una rápida y precisa separación de ácidos nucleicos, específicamente ácido desoxirribonucleico (ADN) surge en el análisis de los productos de la reacción en cadena de polimerasa (RCP) y la secuenciación del ADN, véase, p. ej., Williams, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 4: 227-232 (1992);Drossman et al., Anal. Chem., 62: 900-903 (1990); Huang et al., Anal. Chem., 64: 2149-2154 (1992); y Swerdlow et al., Nucleic Acids Research, 18: 1415-1419 (1990).

Ya que la relación de carga a resistencia a la fricción es la misma para diferentes tamaños de polinucleótidos en solución libre, la separación electroforética de polinucleótidos por lo general conlleva un medio de cribado. Los medios de cribado iniciales de elección fueron por lo general geles reticulados, pero en algunos casos los problemas de estabilidad y producción han conducido al examen de medios poliméricos de cribado líquidos sin gel, tales como poliacrilamida lineal, hidroxialquilcelulosa, agarosa y acetato de celulosa, y similares, p. ej., Bode, Anal. Biochem., 83: 204-210 (1977); Bode, Anal. Biochem., 83: 364-371 (1977); Bode, Ana!. Biochem., 92: 99-110 (1979); Hjerten et al., J. Liquid Chromatography, 12: 2471-2477 (1989); Grossman, patente de EE.UU. n2 5.126.021; Zhu et al., patente de EE.UU. n2 5.089.111; Tietz ef al., Electrophoresis, 13: 614-616 (1992).

Otro factor que puede complicar las separaciones por electroforesis capilar es el fenómeno de la electroendoosmosis. Este fenómeno, a veces denominado electroosmosis o flujo electroendoosmótico (FEO), es el flujo fluido en un capilar provocado por un campo eléctrico. Este fenómeno ha impedido la aplicación de la electroforesis capilar a situaciones donde por lo general se buscan separaciones a alta resolution, tales como en el análisis de fragmentos de secuenciación de ADN. El fenómeno puede surgir en electroforesis capilar cuando la pared interna del capilar contiene cargas inmovilizadas. Dichas cargas pueden dar lugar a la formación de una capa móvil de contraiones que, a su vez, se desplaza en presencia de un campo eléctrico para crear un flujo voluminoso de líquido. Desgraciadamente, la magnitud del FEO puede variar dependiendo de una multitud de factores, como por ejemplo la variación en la distribución de cargas, la adsorción selectiva de componentes del analito y/o el medio de separación, el pH del medio de separación y similares. Debido a que esta variabilidad puede reducirse la capacidad para resolver bandas de analito estrechamente espaciadas, se han hecho muchos intentos para controlar directa o indirectamente dicho flujo. Los intentos han incluido recubrimiento covalente o modificación de la pared interna del capilar para suprimir grupos cargados, utilización de polímeros de alta viscosidad, ajuste de pH y/o concentración del tampón, utilización de un medio de separación de gel para recubrir covalente mente la pared del capilar, y la aplicación de un campo eléctrico radial a los ejes del capilar.

Actualmente, la electroforesis capilar de fragmentos de ácido nucleico se lleva a cabo con frecuencia utilizando capilares recubiertos previamente. Los tubos capilares recubiertos previamente por lo general son costosos de fabricar, tienen una duración limitada, y pueden estar supeditados a problemas de reproducibilidad. Estos problemas son especialmente importantes en electroforesis capilar a gran escala utilizando una serie de capilares múltiples en paralelo.

El documento US n2 5 552 028 A describe polímeros adsorbentes de sílice hidrosolubles sin carga para suprimir el flujo electroendoosmótico y para reducir interacciones analito-pared en electroforesis capilar. Una publicación de Radko et al.(Journal of Chromatography, 848(1-2):443-455 (1999)) trata de selectividad, extensión del pico y resolución en electroforesis de zona capilar de partículas rígidas de tamaño submicrónico en solución se poliacrilamida. La separación de oligonucleótidos y fragmentos de ADN por electroforesis capilar en capilares dinámica y permanentemente recubiertos, utilizando un copolímero de acrilamida y p-D-glucopiranósido como matriz de baja viscosidad con alta capacidad de cribado, es descrita por Chiari et al., Electrophoresis 19(18):3154-3159 (1998).

Compendio de la invención

La presente invención definida por las reivindicaciones proporciona composiciones para la separación de analitos en una muestra. Por ejemplo, resolución monobásica de fragmentos de secuenciación de ADN u otros fragmentos de

polinucleótido. Se proporcionan composiciones como las reivindicadas que comprenden un componente del cribado, que comprenden al menos un polímero de acrilamida no reticulado, de alto peso molecular y baja viscosidad y un componente de interacción con la superficie, que comprende al menos un polímero no reticulado; las composiciones no comprenden un gel de polímero reticulado.

En otro aspecto, la presente invención comprende un elemento de electroforesis capilar. El elemento de electroforesis capilar según se reivindica comprende un capilar no recubierto en el que se inserta una composición para la separación de analitos. La composición situada dentro del capilar comprende un componente del cribado y un componente de interacción con la superficie.

Se proporcionan además kits para la separación de analitos por electroforesis capilar, que comprenden una de las composiciones reivindicadas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 ilustra los datos de la resolución monobásica recogidos por electroforesis capilar de escalas de peso molecular de polinucleótido marcado utilizando temperatura de serie de 50`C y composiciones que comprenden componentes de cribado de polímero de acrilamida no reticulado con pesos moleculares medios de aproximadamente 744.000 daltons (Da) (0,75 M); 1.376.000 Da (1,4 M); 2.015.000 Da (2,0 M); 2.517.000 Da (2,5 M); o 6.377.000 Da (6,4 M). La Figura 1A (parte superior) presenta un gráfico de la resolución monobásica frente al tamaño del fragmento, medida en bases nucleotídicas. La Figura 1B presenta un gráfico del tiempo de migración de fragmentos, en minutos, frente al tamaño del fragmento, medido en bases nucleotídicas.

Figura 2 ilustra los datos de la resolución monobásica recogidos por electroforesis capilar de escalas de polinucleótido marcado utilizando las mismas cinco composiciones descritas en la Figura 1, pero en una serie de temperatura de 60°C. La Figura 2A (parte superior) presenta un gráfico de la resolución monobásica frente al tamaño del fragmento, medida en bases nucleotídicas. La Figura 2B presenta un gráfico del tiempo de migración de fragmentos, en minutos, frente al tamaño del fragmento, medido en bases nucleotídicas.

Figura 3 ilustra los datos de la resolución monobásica recogidos por electroforesis capilar de escalas de polinucleótido marcado utilizando las mismas cinco composiciones descritas en la Figura 1, pero en una serie de temperatura de 70°C. La Figura 3A (parte superior) presenta un gráfico de la resolución monobásica frente al tamaño del fragmento, medida en bases nucleotídicas. La Figura 3B presenta un gráfico del tiempo de migración de fragmentos, en minutos, frente al tamaño del fragmento, medido en bases nucleotídicas.

Figura 4 ilustra el límite de resolución monobásica observado al utilizar composiciones que comprende los cinco componentes del cribado descritos en la figura 1 en la serie de temperaturas de SO'C, eO'C o 70°C. Los límites de resolución monobásica se estimaron por inspección... [Seguir leyendo]

1. Una composición para separar analitos por electroforesis capilar que comprende:

un componente de cribado que comprende un polímero de acrilamida no reticulado que tiene un peso molecular medio ponderado mayor de 1.000.000 Daltons (Da) y menos de o igual a 3.000.000 Da; y

un componente de interacción con la superficie que comprende uno o más homopolímeros y copolímeros de acrilamida hidrófobos N-alquil-sustituidos de fórmula:

en donde R7 es -H o -CH3, Rg y Rs son independientemente -H, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH2CH3, CH(CH3)2 o - CH2CONH2, y caracterizado por que z oscila entre aproximadamente 2.000 y 50.000, oscilando el peso molecular medio entre 200.000 Da y 5.000.000 Da,

en donde el componente de cribado y el componente de interacción con la superficie son diferentes;

en donde la composición tiene una viscosidad inferior a 1000 mPa-s a 25°C; y en donde la composición no comprende un gel de polímero reticulado.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición tiene una viscosidad inferior a 600 mPa-s a 25°C.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde componente de interacción con la superficie comprende poli(N,N- dimetilacrilamida).

4. La composición de la reivindicación 3, en donde el peso molecular medio ponderado de la poli(N,N- dimetilacrilamida) oscila entre 200.000 Da y 5.000.000 Da.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde uno o más polímeros que comprenden el componente de interacción con la superficie están presentes a una concentración desde aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10% peso:peso (p:p).

6. La composición de la reivindicación 1, en donde uno o más polímeros que comprenden el componente de interacción con la superficie están presentes a una concentración desde aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%peso:peso (p:p).

7. La composición de la reivindicación 1, que comprende además al menos un desnaturalizante que se selecciona del grupo consistente en formamida, urea y 2-pirrolidinona.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde al menos un desnaturalizante comprende urea.

9. Un elemento de electroforesis capilar que comprende: un capilar no recubierto; y

una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 situada dentro del capilar no recubierto.

10. Un kit para separar analitos por electroforesis capilar que comprende una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

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