Método de separación de células por medio del uso de un sistema de liberación para conjugados célula-anticuerpo-sustrato que contiene una unidad espaciadora de polietilenglicol.

Método para la separación de células objetivo a partir de una muestra de células que comprende las etapas:

a) incubar la muestra de células con un conjugado desprendible que comprende un ligando biotinilado que tiene una porción biotina, una porción ligando (Ligando1) y una molécula de unión a biotina (bbm) unida a la porción biotina del ligando biotinilado, en donde la porción biotina y la porción ligando del ligando biotinilado están separadas por un grupo espaciador que consiste en polietilenglicol de acuerdo con la Fórmula general I**Fórmula**

con n ≥ 1 - 500, y X, Y ≥ iguales o diferentes, grupos alquilo sustituido que tienen 1 a 20 átomos de carbono con residuos amina, amida, y/o tioéter,

en donde el ligando es un primer anticuerpo para el que las células objetivo expresan un antígeno, y la molécula de unión a biotina (bbm) es un segundo anticuerpo que comprende una partícula magnética como soporte sólido,

b) separar las células marcadas con el soporte sólido obtenido en la etapa a) a partir de la muestra de célula al aplicar un campo magnético,

c) añadir un agente de liberación en una concentración suficiente para desplazar la molécula de unión a biotina (bbm) de la porción biotina del ligando biotinilado.

Descripción Método de separación de células por medio del uso de un sistema de liberación para conjugados célula-anticuerposustrato que contiene una unidad espaciadora de polietilenglicol.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método de separación de células por medio del uso de un sistema de liberación para conjugados célula-anticuerpo-sustrato que incluye un método para disociar selectivamente los conjugados.

Antecedentes de la invención La habilidad de la biotina para unirse a la estreptavidina, la avidina, y otras moléculas de unión a biotina se ha explotado por varias décadas, debido a la alta afinidad, especificidad y amplia aplicabilidad de este sistema.

Para mejorar las propiedades de liberación de los sistemas de afinidad biotina/estreptavidina, se introducen derivados de biotina y estreptavidina modificados químicamente, en donde solamente uno o inclusive ambas parejas de unión se modificaron. Tales modificaciones disminuyen la estabilidad del complejo biotina/estreptavidina en varios órdenes de magnitud y de ese modo facilitan la disociación de las dos parejas de unión (ver por ejemplo US 20080255004) . Además, se desarrollaron proteínas de estreptavidina mutadas con reducida afinidad por la biotina o sus análogos (M. Qureshi y otros, J. Biol. Chem. 276 (2001) 46422-46428; T. Sano y otros, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 31803184) . US 5506121 describe las llamadas "etiquetas-estrept" es decir péptidos con afinidad de unión disminuida por la estreptavidina.

La modificación de la biotina o la estreptavidina es laboriosa. A partir de que muchos reactivos para el acoplamiento de la biotina con sustratos, como los anticuerpos, están disponibles comercialmente, es ampliamente extendido usar la biotina no modificada como agente de marcaje.

En este sentido, US 5215927 describe el aislamiento de células objetivo al poner en contacto la población de células deseada con un anticuerpo monoclonal y la subsecuente incubación con una inmunoglobulina anti-especies biotinilada dirigida al anticuerpo monoclonal específico. La mezcla se separa sobre una fase sólida que comprende avidina inmovilizada como molécula de unión a biotina, lo que facilita la inmovilización de las células objetivo y la separación de los objetivos no marcados. Las células deseadas subsecuentemente se liberan por agitación mecánica para romper el complejo inmovilizado.

El uso de mecanismos de liberación mediados por la degradación por enzimas no selectiva, reacciones químicas, fuerzas mecánicas intensas, alta temperatura, o condiciones salinas fuertes no son deseables para la separación de células vivas, porque es importante preservar la integridad y viabilidad de las células. En consecuencia, se desean mecanismos que permitan la rápida y selectiva liberación de las células objetivo en condiciones fisiológicas.

Alternativamente al clivaje enzimático o químico o al uso de moléculas biotina/estreptavidina modificadas, los sistemas biotina/estreptavidina además se pueden clivar por un mecanismo de competencia con el ligando. Por ejemplo, una molécula biotinilada se puede liberar de un soporte de estreptavidina por la adición de un exceso de biotina libre, de ese modo reemplaza a la molécula biotinilada.

Los métodos basado en la competencia de la biotina o la estreptavidina libres contra las contrapartes respectivas (estreptavidina o biotina) se conocen en numerosas variantes. James Hirsch y otros dan una visión general de estas técnicas en Analytical Biochemistr y 308 (2002) 343-357.

Además, Ke Shan y otros describen en "Avidin-Biotin-PEG-CPA Complexes as Potential EPR-Directed Therapeutic Protein Carriers: Preparation and Characterization", Bioconjugate Chemistr y , vol. 18, núm. 5, 1 de septiembre 2007 (2007-09-01) , páginas 1644-1650e "Intermolecular interaction of avidina and PEGylated biotin", Bioconjugate Chemistr y , vol. 18, núm. 6, 21 de noviembre 2007 (2007-11-21) , páginas 2109-2114, el uso de la biotina para la disociación de los complejos Avidina-Biotina-PEG-Enzima. Un método similar se describe por Rampersaud y otros: "Novel discrete PEGbased crosslinking reagents for conjugation of antibodies and proteins to biotin, fluorochromes, enzymes and gold that eliminate aggregation, improves solubility, reduces non-specific binding and enhances low level detection limits" in MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, vol. 22, 2011, página 1931.

La reacción de competencia de la biotina/estreptavidina libre contra las respectivas contrapartes unidas se describe en el documento WO 92/16841 para medios analíticos.El documento WO 92/16841 describe entre otros un método para detectar una molécula reportera, que se une específicamente a un analito y una fase insoluble mediante un sistema de unión estreptavidina/biotina. Después del procedimiento de trabajo, el sistema de unión estreptavidina/biotina se cliva por un ligando de desplazamiento y el analito liberado se detecta analíticamente mediante una molécula reportera.

US 2008/0255004, US 6869606, y US 4656252 describen anticuerpos biotinilados que comprenden biotina modificada, en donde la porción biotina y la porción anticuerpo de los anticuerpos biotinilados se separan por un grupo espaciador que consiste en un arilo, alquilo, o grupo ácido aminocaprólico. El uso de los grupos hidrofóbicos arilo o alquilo se espera que cause aglomeración en soluciones acuosas. A partir de que las condiciones fisiológicas de los sistemas biológicos usualmente requieren soluciones acuosas, la aglomeración es un problema eminente para las técnicas que usan sustancias bastante hidrofóbicas. Las moléculas espaciadoras derivadas a partir del ácido amino caprólico (llamadas "enlazador LC") poseen una cadena de alquilo lineal con residuos que soportan químicas de bioconjugación homo-o heterofuncionales.

US 5518882 describe un método similar, en donde las células objetivo se unen a un soporte sólido, por ejemplo partículas magnéticas. Esto permite un enriquecimiento adicional por la aplicación de un campo magnético, que inmoviliza las células objetivo acopladas a las perlas magnéticas. Las células objetivo se puede liberar de las partículas por el clivaje del sistema de unión a biotina con un ligando de desplazamiento. Preferentemente, el conjugado " (perla magnética) -antibiotina-biotina-anticuerpo-célula" se cliva por la adición de estreptavidina libre en acceso, lo que resulta en un conjugado " (perla magnética) -antibiotina" y uno "estreptavidina-biotina-anticuerpo-célula" .

Generalmente, una reacción de competencia, es decir el desplazamiento de un primer ligando con un segundo ligando solo procederá hasta que se alcance el equilibrio entre las cinéticas de la reacción de unión del primer y el segundo ligando. El equilibrio depende de las respectivas fuerzas de unión y concentraciones del ligando y las condiciones termodinámicas de la reacción. Las reacciones de competencia conocidas desplazan la biotina por estreptavidina por lo tanto llevan ya sea a una liberación incompleta o son difíciles de controlar ya que las cinéticas subyacentes usualmente no se conocen.

Los actuales sistemas de liberación no son suficientemente rápidos o fiables para un proceso que involucra el marcaje de células vivas, la separación o detección de células y el desmarcaje de las células objetivo.

Breve descripción de la invención Fue por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar un sistema de liberación fiable y altamente eficiente que comprende un anticuerpo biotinilado para la detección de células vivas para usar en un método de separación de células.

Sorprendentemente, se encontró que la afinidad de unión de una pareja de unión marcada dirigida a la porción biotina de un anticuerpo biotinilado se puede ajustar por la colocación de una molécula espaciadora biocompatible entre la porción biotina y el anticuerpo, en donde la pareja de unión marcada está provista con un medio de detección. Con tal conjugado, las células pueden marcarse primero para la identificación o el aislamiento y después de la identificación o el aislamiento, la marca se puede retirar para desmarcar las células objetivo deseadas.

El objetivo de la invención es por lo tanto un método para la separación de células objetivo a partir de una muestra de células que comprende las etapas:

a) incubar la muestra de células con un conjugado desprendible que comprende un ligando biotinilado que tiene una porción biotina, una porción ligando (Ligando1) y una molécula de unión a biotina (bbm) unida a la porción biotina del 45 ligando biotinilado, en donde la porción biotina y la porción ligando del ligando biotinilado están separadas... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones

1. Método para la separación de células objetivo a partir de una muestra de células que comprende las etapas:

a) incubar la muestra de células con un conjugado desprendible que comprende un ligando biotinilado que tiene

una porción biotina, una porción ligando (Ligando1) y una molécula de unión a biotina (bbm) unida a la porción

biotina del ligando biotinilado, en donde la porción biotina y la porción ligando del ligando biotinilado están

separadas por un grupo espaciador que consiste en polietilenglicol de acuerdo con la Fórmula general I

** (Ver fórmula) **

con n = 1 -500, y X, Y = iguales o diferentes, grupos alquilo sustituido que tienen 1 a 20 átomos de carbono con residuos amina, amida, y/o tioéter, en donde el ligando es un primer anticuerpo para el que las células objetivo expresan un antígeno, y la molécula de unión a biotina (bbm) es un segundo anticuerpo que comprende una partícula magnética como soporte sólido, b) separar las células marcadas con el soporte sólido obtenido en la etapa a) a partir de la muestra de célula al aplicar un campo magnético, c) añadir un agente de liberación en una concentración suficiente para desplazar la molécula de unión a biotina (bbm) de la porción biotina del ligando biotinilado.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque posterior a la etapa c) , en una etapa opcional d) la molécula de unión a biotina (bbm) se separa de las células objetivo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado porque la etapa d) se lleva a cabo al aplicar un 35 campo magnético.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque la etapa b) y c) se llevan a cabo en al menos una columna que contiene material ferromagnético.

5. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque el ligando comprende una unidad cromófora, una unidad de fluorescencia, o una unidad radioactiva como medios de detección.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque los medios de 45 detección del ligando y/o la molécula de unión a biotina (bbm) se detectan posterior a la etapa c) para detectar las células objetivo.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque el ligando es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo dirigido contra el antígeno expresado intracelular o extracelular.

8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el conjugado desprendible tiene la Fórmula general IIa, IIb, o IIc

** (Ver fórmula) **

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el agente de liberación es biotina o estreptavidina.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 caracterizado porque en la etapa c) , un agente de liberación auxiliar que tiene las Fórmulas generales VII, VIII, o IX

** (Ver fórmula) **

con R1-3, 5-13 = el mismo o diferente hidrógeno, o residuos alquilo sustituido o no sustituido que tienen 1 -20 átomos de carbono y R4 = residuos alquilo sustituido o no sustituido, que tienen 1 -20 átomos de carbono se 50 proporciona adicionalmente.