Material de cultivo celular derivado de plantas.

Composición de cultivo celular o de suministro de células, caracterizada por que la composición comprende nanofibras de celulosa derivadas de plantas,

disgregadas mecánicamente, y/o sus derivados, en forma de un hidrogel o membrana en estado húmedo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FI2011/050939.

Solicitante: UPM-KYMMENE CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Finlandia.

Dirección: Eteläesplanadi 2 00130 Helsinki FINLANDIA.

Inventor/es: YLIPERTTULA,MARJO, LAURÉN,PATRICK, BHATTACHARYA,MADHUSHREE, LOU,YANRU, LAUKKANEN,ANTTI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61L27/36 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61L PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES U OBJECTOS EN GENERAL; DESINFECCION, ESTERILIZACION O DESODORIZACION DEL AIRE; ASPECTOS QUIMICOS DE VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS; MATERIALES PARA VENDAS, APOSITOS, COMPRESAS ABSORBENTES O ARTICULOS QUIRURGICOS (conservación de cuerpos o desinfección caracterizada por los agentes empleados A01N; conservación, p. ej. esterilización de alimentos o productos alimenticios A23; preparaciones de uso medico, dental o para el aseo A61K). › A61L 27/00 Materiales para prótesis o para revestimiento de prótesis (prótesis dentales A61C 13/00; forma o estructura de las prótesis A61F 2/00; empleo de preparaciones para la fabricación de dientes artificiales A61K 6/02; riñones artificiales A61M 1/14). › que contienen ingredientes de composición indeterminada o sus productos de reacción.
  • A61L27/38 A61L 27/00 […] › Células animales (para utilizar en piel artificial A61L 27/60).
  • C12N5/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00).

PDF original: ES-2537268_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Material de cultivo celular derivado de plantas.

Campo de la invención La invención se refiere a composiciones de cultivo celular y de suministro de células derivadas de plantas, que comprenden nanofibras de celulosa y/o sus derivados.

Antecedentes de la invención El cuidado de la salud sigue encontrándose en las fronteras principales para la investigación científica. La necesidad de descubrir y desarrollar medicamentos baratos y más seguros siempre crece. La capacidad para modelar de forma exacta la organización celular en un tejido u órgano particular es de suma importancia. Una réplica muy buena del sistema in vivo a in vitro requeriría el crecimiento celular en tres dimensiones (3D) . La "intercomunicación" lograda entre las células en un cultivo celular 3D in vitro es un buen remedo del crecimiento celular en condiciones fisiológicas. De hecho, el cultivo celular 3D ha asumido importancia en los esfuerzos dirigidos hacia la medicina regenerativa, comprendiendo mejor las enfermedades crónicas y proporcionando un sistema modelo in vitro superior para identificar fármacos y ensayos toxicológicos. Su emergencia está siendo así publicitada acertadamente como "nueva dimensión de la biología".

Los esfuerzos de investigación intensos se encuentran en identificar y desarrollar "factores y armazones" que favorecerían el crecimiento celular 3D in vitro. Las células en condiciones fisiológicas no solo se "intercomunican" entre ellas sino que también interaccionan con el microentorno celular, la matriz extracelular (ECM) , con la que residen. La ECM proporciona el soporte estructural a las células, y también contribuye a la señalización y direccionamiento del destino celular. Generalmente, la ECM está compuesta de glicosaminoglicanos y proteínas fibrosas tales como colágeno, elastina, laminina y fibronectina autoensambladas en una red nanofibrilar. Un armazón ideal para el crecimiento celular 3D debería de ser capaz de remedar el componente estructural de la ECM nativa, dar soporte al crecimiento celular y el mantenimiento, tener la red de tamaño correcto de poros interconectados para la migración celular eficiente, y transferir los nutrientes a las células. En esencia, las propiedades mecánicas y químicas del armazón deberían de conducir a la función celular como en el estado nativo.

Los hidrogeles, tanto de origen sintético como natural, han surgido como armazones adecuados para el cultivo celular 3D. La red de poros interconectados en hidrogeles permite la retención de una gran cantidad de fluido biológico, facilita el transporte de oxígeno, nutrientes y desechos. Además, la mayoría de los hidrogeles se pueden formar en condiciones citocompatibles suaves, y las propiedades biológicas se pueden modular mediante química de superficie. Los hidrogeles manipulados mediante ingeniería, con propiedades mecánicas, químicas y biológicas modificadas, tienen el potencial de imitar la ECM y establecer de este modo su utilidad en el cultivo 3D. Los productos comerciales para el cultivo celular 3D son, por ejemplo, PuraMatrix (3DM Inc.) y Matrigel (BD Biosciences) . PuraMatrix es un hidrogel de nanofibras peptídicas autoensambladas que se asemeja a la estructura de colágeno fibrilar natural en la ECM, con un diámetro de fibras de 5-10 nm. También tiene un contenido elevado de agua, típicamente 99, 5%. La patente US nº 7.449.180 y el documento WO 2004/007683 describen hidrogeles peptídicos. Matrigel es una mezcla de proteínas gelatinosa segregada por células tumorales de ratón. La mezcla se asemeja al entorno extracelular complejo encontrado en muchos tejidos, y se usa por biólogos celulares como sustrato para el cultivo celular. MaxGel ECM Matrix (Sigma-Aldrich) , que incluye una mezcla de componentes de la ECM humana, forma un gel a temperatura ambiente.

La celulosa bacteriana se ha usado en membranas de curación de heridas y como armazón en cultivo celular. La limitación en la utilización de celulosa bacteriana en cultivo celular es la estructura inherente del material fermentado; con el cultivo, la BC se forma como membranas muy compactas en la interfaz de aire con agua en el fermentador. Las membranas formadas son demasiado compactas para muchas tareas de cultivo celular 3D, y son necesarias diversas modificaciones para mejorar la porosidad, que es necesaria para la penetración celular y formación de agrupamientos celulares.

Los materiales de hidrogel también se usan ampliamente en otros tipos de tareas de cultivo en las que es necesario material de soporte hidrófilo; por ejemplo, los hidrocoloides de tipo agar se usan ampliamente en el cultivo de células vegetales, bacterias y hongos para diversos fines microbiológicos.

La patente US nº 5.254.471 describe un portador para cultivar células hecho de fibras ultrafinas. El documento WO 2009/126980 describe hidrogel a base de celulosa, que contiene celulosa que muestra un grado medio de polimerización de 150-6200.

Se ha descubierto que las soluciones de la técnica anterior son más bien insatisfactorias en el cultivo celular. Todos los actuales métodos y matrices de cultivo celular 2D y 3D requieren el uso de sustancias químicas o compuestos a base de animales en los medios biomateriales a fin de que las células se mantengan y se multipliquen. El mantenimiento de células troncales es especialmente exigente, y no existen soluciones simples para la matriz usada

con el medio de cultivo celular que mantuviese vivas a las células troncales. La presencia de compuestos a base de animales en el entorno del cultivo celular genera un riesgo importante de inmunorreacciones, y diferentes tipos de aspectos de toxicidad, que finalmente exterminarán a las células cultivadas. Las matrices de cultivo celular que contienen aditivos a base de animales no son adecuadas para el uso con células troncales, especialmente si las células troncales se van a usar para el transplante de tejidos y tecnología tisular (manipulación mediante ingeniería) . Además, muchos de los polímeros propuestos para uso en los medios de cultivo celular no toleran una temperatura fisiológica, o son tóxicos para las células.

Breve descripción de la invención Existe una clara necesidad de un material de cultivo celular mejorado que sea capaz de proporcionar soporte tri-o bidimensional para diversos tipos celulares. Esos modelos celulares 3D funcionales se pueden utilizar como herramientas en el descubrimiento de fármacos, sustituyendo a los experimentos con animales y siendo más avanzados que los modelos celulares 2D usados actualmente. El transporte de células cultivadas es también muy deseable, por ejemplo cuando el objetivo es la transferencia tisular o la terapia celular. La posibilidad de transferir agrupamientos de células cultivadas en matriz 3D es deseable cuando se están desarrollando diferentes modelos celulares in vitro. Los biomateriales de cultivo celular 3D existentes no permiten transferir la matriz de hidrogel con una aguja sin dañar seriamente a las células cultivadas.

Un objetivo de la presente invención es de este modo proporcionar un nuevo enfoque para resolver o aliviar al menos parcialmente los problemas mencionados anteriormente que surgen en la técnica anterior. Los objetivos de la invención se logran mediante una composición de cultivo celular o de suministro de células que comprende nanofibras de celulosa o un derivado de las mismas que se caracteriza por lo que se manifiesta en las reivindicaciones independientes. Las formas de realización preferidas se describen en las reivindicaciones dependientes.

La presente invención se basa en el uso de nanofibras de celulosa y/o sus derivados en matriz de cultivo celular 2D y 3D. La presente invención proporciona la utilización de nanofibras de celulosa y/o sus derivados en la matriz de cultivo celular. La utilización de nanofibras de celulosa y/o sus derivados como matriz de cultivo celular 2D y 3D elimina la necesidad de usar aditivos a base de animales para multiplicar y lograr la proliferación de células en una matriz que contiene las nanofibras de celulosa y/o sus derivados.

Se ha descubierto sorprendentemente que el hidrogel de CNF derivado de planta se puede usar sin ninguna modificación como ECM humana biomimética para cultivo celular 3D. Los datos de proliferación y viabilidad celulares sugieren que el hidrogel CNF es un biomaterial óptimo para armazones celulares 3D para ensayos de identificación de alto rendimiento a base de células funcionales avanzados en el desarrollo de fármacos, en pruebas de toxicidad de fármacos y en medicina regenerativa y además para el suministro de células in vivo.

Se describen por primera vez las propiedades físicas y de biocompatibilidad de hidrogel de CNF derivado de planta. La celulosa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Composición de cultivo celular o de suministro de células, caracterizada por que la composición comprende nanofibras de celulosa derivadas de plantas, disgregadas mecánicamente, y/o sus derivados, en forma de un hidrogel o membrana en estado húmedo.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada por que el diámetro de nanofibras de celulosa o haces de nanofibras en las nanofibras de celulosa y/o sus derivados es inferior a 1 µm, preferentemente inferior a 200 nm, más preferentemente inferior a 100 nm.

3. Composición según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que las nanofibras de celulosa y/o sus derivados comprenden derivados modificados química o físicamente de una nanofibra de celulosa o haces de nanofibras.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada por que las nanofibras de celulosa disgregadas mecánicamente se pretratan por ácido-base.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que la composición comprende además unos aditivos seleccionados de entre el grupo que consiste en componentes de la matriz extracelular, suero, factores de crecimiento y proteínas.

6. Matriz de cultivo celular o de suministro de células, caracterizada por que la matriz comprende células vivas y una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que forma un hidrogel, y las células están presentes en dicha matriz en una disposición tridimensional o bidimensional.

7. Matriz según la reivindicación 6, caracterizada por que las células son células eucariotas o células procariotas.

8. Procedimiento para producir una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes

- proporcionar nanofibras de celulosa derivadas de plantas, disgregadas mecánicamente, y/o sus derivados, -mezclar conjuntamente dichas nanofibras de celulosa y/o sus derivados con agua.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado por que el procedimiento comprende además combinar la mezcla con un medicamento adecuado.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 o 9, caracterizado por que las nanofibras de celulosa disgregadas mecánicamente se pretratan por ácido-base.

11. Procedimiento para eliminar nanofibras de celulosa a base de plantas y/o sus derivados de un material de cultivo celular, caracterizado por que el procedimiento comprende las etapas siguientes -proporcionar un material que comprende medio de cultivo celular y células; -diluir dicho material con líquido acuoso o no acuoso;

- centrifugar opcionalmente el material para sedimentar las células y los agregados celulares; -eliminar las nanofibras de celulosa por decantación.

12. Procedimiento para eliminar nanofibras de celulosa a base de plantas y/o sus derivados de un material de cultivo celular, caracterizado por que el procedimiento comprende las etapas siguientes -proporcionar un material que comprende medio de cultivo celular y células; -poner en contacto el material de cultivo celular con una enzima degradante;

- centrifugar opcionalmente el material para sedimentar las células y los agregados celulares; -eliminar las nanofibras de celulosa por decantación.

13. Utilización microbiológica de nanofibras de celulosa derivadas de plantas, disgregadas mecánicamente, y/o sus derivados o la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con fines de laboratorio y/o industriales como un medio o un compuesto de medios para mantener células in vitro.

14. Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para inmovilizar células o enzimas.

15. Procedimiento para cultivar células, caracterizado por que el procedimiento comprende las etapas siguientes -proporcionar células.

5. poner en contacto las células con una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para formar una matriz;

- cultivar las células en el interior de dicha matriz en una disposición tridimensional o bidimensional. 10

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado por que antes del cultivo la matriz se transfiere o se coloca en un entorno para cultivo celular o para suministro de células.

17. Composición, procedimiento o utilización según una o más de las reivindicaciones anteriores, en los que las 15 células son células eucariotas.

18. Composición, procedimiento o utilización según una o más de las reivindicaciones anteriores, en los que las células son células procariotas.

19. Composición, procedimiento o utilización según una o más de las reivindicaciones anteriores, en los que las células son células troncales.


 

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