Línea celular tumoral resistente a fármacos IM-9R y su empleo en la búsqueda de nuevos tratamientos anti-tumorales.

Línea celular tumoral resistente a fármacos IM-9R y su empleo en la búsqueda de nuevos tratamientos anti-tumorales.

IM-9R es una línea celular resistente a fármacos que expresa la proteína MDR-1 y que tiene capacidad extrusora de fármacos. Además, presenta sensibilidad colateral a hipotermia y un perfil de expresión de proteínas Bcl-2 asociado con fenotipo MDR. Dicha línea permitirá la puesta a punto de nuevas terapias dirigidas al tratamiento de tumores quimio-resistentes y posibilitará el diseño de test predictivos de respuesta a fármacos que permitan analizar nuevas moléculas y sus combinaciones para el tratamiento personalizado de los pacientes con procesos neoplásicos. Adicionalmente, la línea IM-9R permitirá identificar moléculas de señalización intracelular implicadas en el proceso de sensibilidad colateral a hipotermia, las cuales podrían constituir nuevas dianas terapéuticas en el tratamiento de tumores MDR. Finalmente, dicha línea celular posibilitará la identificación de inhibidores de MDR-1 y de proteínas Bcl-2, como Mcl-1.

Línea celular tumoral resistente a fármacos IM-9R v su empleo en la búsqueda de nuevos tratamientos anti-tumorales.

Objeto de la invención

La presente invención consiste en una nueva línea celular de gran utilidad para el descubrimiento de nuevos fármacos que mejoren el tratamiento de pacientes con cáncer resistente a múltiples fármacos, así como para el descubrimiento de inhibidores de la bomba de extrusión de fármacos MDR-1 y de Mcl-1, para la identificación de moléculas señalizadoras implicadas en sensibilidad colateral a hipotermia y para la puesta a punto de test predictivos que permitan suministrar una terapia personalizada a dichos pacientes.

Sector de la técnica

Sector farmacéutico y laboratorios de investigación y desarrollo biotecnológico y biomédico.

Estado de la técnica

Desde el inicio de los tratamientos quimioterapéuticos en cáncer, la causa principal del fallo en la respuesta a dichos fármacos ha sido la adquisición de fenotipo MDR por parte de las células tumorales del paciente. El incremento en el número de nuevos fármacos quimioterapéuticos no ha sido capaz de reducir de forma eficiente la aparición de dichas resistencias. Por ello, es necesaria la búsqueda y caracterización de nuevos fármacos y/o estímulos de estrés capaces de eliminar células con fenotipo quimio-resistente utilizando líneas celulares que puedan ser empleadas en el cribado a gran escala de dichas moléculas y/o estímulos.

Por todo ello, es necesario disponer de líneas celulares tumorales quimio- resistentes que puedan ser utilizadas en test predictivos de respuesta a fármacos que permitan determinar in vitro el efecto de distintos tratamientos (terapia convencional y nuevos tratamientos) en células tumorales con fenotipo MDR. Se trata de sentar las bases de un terapia que posibilite establecer la combinación óptima de fármacos que contribuyan al diseño de terapias más efectivas y menos tóxicas frente a los procesos neoplásicos.

La nueva línea celular tumoral (IM-9R) desarrollada en laboratorio presenta fenotipo MDR y sensibilidad colateral a hipotermia y puede ser utilizada para probar distintas estrategias terapéuticas in vitro e in vivo.

El interés comercial de estas investigaciones y de las líneas celulares con fenotipo MDR se muestra en el artículo de Nature America Inc (Nature Biotechnology, 18 (sup): IT 18-20; 2000) en el que se cita hasta 15 empresas del sector biotecnológico y farmacéutico que desarrollaban programas de investigación propios, buscando nuevos fármacos para tratar a pacientes con tumores resistentes a quimioterapia, describiendo a este campo de investigación como una de las vías más interesantes para descubrir nuevos tratamientos más eficaces por parte de estos sectores industriales.

Además, en nuestro propio laboratorio, se desarrolló durante los años 2009-2011 un proyecto de investigación con la empresa Villapharma Research S.L. relacionada con el ensayo de nuevos compuestos para probar su eficacia sobre la línea celular de leucemia de ratón con fenotipo MDR, L1210R, obteniéndose resultados prometedores, sin poder citarse éstos al estar sujetos a confidencialidad con la empresa (Título del proyecto: Diseño, desarrollo, síntesis y evaluación de la actividad biológica de nuevos potenciales fármacos en el campo de la oncología y la inflamación. Fechas: 14/05/2010 - 14/05/2012).

En relación a patentes similares a la presentada, cabe destacar patentes referidas a líneas celulares que han desarrollado fenotipo MDR y expresión de P-gp como la patente CN102268406(A) titulada: BREAST CARCINOMA DRUG

RESISTANCE CELL LINES ORIGINATED FROM BCAP7, AND APPLICATIONS THEREOF, referida a una línea celular con fenotipo MDR y capacidad de expresión de la bomba de extrusión de fármacos P-gp y sus usos para estudiar los mecanismos de la resistencia a quimioterapia, para investigar la posible reversión del fenotipo MDR, extraer marcadores de resistencia a quimioterapia en tumores y probar y evaluar nuevos tratamientos antitumorales entre otros usos. Patente CN1884493(A) titulada MULTIPLE MEDICINE-RESISTANT CELL LINE FOR LUNG CANCER, referida al desarrollo de una línea celular con fenotipo MDR de cáncer de pulmón y sus usos para analizar la morfología y los cambios en la fisiología celular que se producen tras la adquisición de este fenotipo, así como para probar nuevos tratamientos contra los tumores con fenotipo MDR. Patente CN102787098(A) titulada HUMAN GASTRIC CARCINOMA MULTI- DRUG-RESISTANCE CELL LINE, referida a una línea celular con fenotipo MDR obtenida mediante la transfección con un plásmido codificante de la proteína P- gp, por lo que el fenotipo MDR se debe a la expresión de esta bomba de extrusión de fármacos, refiriéndose esta patente también a la utilización de esta línea celular en una plataforma de ensayos biológicos de la actividad de P-gp. Patente KR20110021493(A) titulada DOCETAXEL RESISTANT PROSTATE CANCER CELL LINE, referida a la obtención de una línea celular tumoral con fenotipo MDR obtenida mediante exposición continuada al fármaco docetaxel. Patente US2007254330(A1) referida a un método para desarrollar un panel de líneas celulares tumorales de pulmón con fenotipo MDR y expresión de P-gp así como a las líneas celulares desarrolladas por este método. También cabe destacar la patente US2013130223 titulada: NOVEL CONDITIONALLY IMMORTALIZED HUMAN PROXIMAL TUBULE CELL LINE EXPRESSING FUNCTIONAL INFLUX AND EFFLUX TRANSPORTERS, donde se describe una novedosa línea celular humana (inmortalizada a partir de células del túbulo proximal renal) que expresa el transportador MRP-4 (ABCC4) con funcionalidad extrusora, siendo también objeto de protección en esta patente una línea celular que no tiene fenotipo MDR pero sí expresa una bomba de extrusión de fármacos; así como la patente CN102827811 titulada: HUMAN BREAST CANCER CHRONIC INTERMITTENT HYPOXIA CELL LINE, AND PREPARATION METHOD THEREOF, donde se describe una línea celular de cáncer de mama derivada de la línea celular MCF-7

que se llama MCF-7H y que es resistente al proceso de hipoxia mediante sobreexpresión de proteínas reguladoras de las vías de señalización que se activan frente a este tipo de estrés/tratamiento; caracterizándose esta línea celular por una respuesta diferencial frente a un estrés físico como es la hipoxia.

Finalmente, también cabe destacar la patente US2011/0135633(A1) titulada: CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA CELL UNE, referida a la obtención de una línea celular de leucemia linfocítica crónica y a sus usos en investigación del tratamiento de esta enfermedad.

Descripción de la invención

Breve descripción de la invención

La línea celular leucémica humana resistente a fármacos IM-9R derivada de la línea celular IM-9 se ha obtenido mediante exposición continuada al fármaco daunomicina (DNM), como se señala en el esquema de la figura 1. Esta nueva línea celular presenta una mayor resistencia al tratamiento con DNM que la línea parental de la que procede, con un valor de 5,2 para el índice de resistencia frente a la daunomicina. Otra característica fundamental de la nueva línea celular es la expresión de la bomba de extrusión de fármacos MDR-1 (P-gp, ABCB1) que es completamente funcional como lo demuestra el hecho experimental de que es capaz de expulsar del interior celular el compuesto Rhodamina 123 (sustrato de MDR-1) (Legrand O. et al., 2001; Altenberg GA et al., 1994). Adicionalmente, las células IM-9R presentan sensibilidad colateral a hipotermia, de forma que la exposición a bajas temperaturas (4°C) induce en dichas células un mayor porcentaje de muerte celular que en las células parentales de las que proceden. Además, las células IM-9R expresan altos niveles de proteínas de la familia Bcl-2 como es el caso de la proteína Mcl-1 que está muy relacionada con la aparición de fenotipo MDR en células tumorales. Finalmente, las células IM-9R tienden a formar agregados en el cultivo observables mediante microscopía óptica (característica morfológica típica de las células con fenotipo MDR) (Kenneth H et al., 2011).

Descripción detallada de ia invención

La línea celular IM-9R presenta características propias de una línea celular con

fenotipo de resistencia a múltiples fármacos o fenotipo MDR, al contrario que la

línea celular IM-9 de la que procede. Estas características son:

1. Mediante microscopía óptica se observa una mayor agregación celular en cultivo.

2. Resistencia al fármaco daunomicina 5,2 veces mayor que la línea celular parental de la que procede. En la figura 2 se observa esta diferencia respecto a la línea celular parental IM-9, donde se representan los valores de IC50...

1. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, indicada para la búsqueda de nuevas moléculas o estímulos de estrés que puedan ser utilizados en el tratamiento de procesos neoplásicos y con aplicaciones circunscritas a los campos de la investigación biotecnológica y farmaceútica como test in vitro o in vivo, caracterizada por presentar un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos o fenotipo MDR y sensibilidad colateral a hipotermia, a diferencia de la línea IM-9 de la que procede.

2. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, según reivindicación 1, caracterizada por presentar una manifiesta agregación celular en su crecimiento en cultivo a diferencia de la escasez de agregación celular que presenta la línea parental de la que procede.

3. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, según reivindicación 1, caracterizada porque expresa la bomba de extrusión de fármacos MDR-1/P- gp/ABCB1.

4. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, según reivindicaciones 1 y 3, caracterizada porque presenta capacidad extrusora de compuestos que sean sustrato de MDR-1.

5. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, según reivindicación 1, caracterizada porque presenta elevada expresión de una proteína anti- apoptótica de la familia Bcl-2 relacionada con la adquisición de fenotipo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) denominada Mcl-1.

6. Línea celular tumoral, IM-9R, resistente a fármacos, según reivindicación 1, caracterizada porque presenta sensibilidad colateral a estrés hipotérmico.