Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas.

Un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que,

en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas**Fórmula**

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, - COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto R8 como R9 son H y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o R13, o ambos, son H y R14 o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula**

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula**

Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas

La presente invención se refiere a un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD 5 resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que, en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre 15 fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyeles opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyeles seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto Rs como R9 son H 20 y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o R13, o ambos, son H y RM o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SFs, OR y C02H y en las que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tiene la fórmula R.

r3 r4

O N

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SFs, OR y CO2H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente 30 sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tiene la fórmula

o

G

O

O

y sus sales agronómicamente aceptables, donde el grupo G se escoge entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente y donde Ri-R2 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

en comparación con herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

y sus sales agronómicamente aceptables, donde los grupos Ar K y J se escogen independientemente entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente, donde los sustituyentes opcionales para los grupos Ky J incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, - S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SFs, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1-R4 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-S02R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

donde dicha enzima de HPPD de control se obtiene a partir de una dicotiledónea, particularmente de Arabidopsis o del tabaco;

donde la resistencia de las enzimas de HPPD a herbicidas se determina midiendo la velocidad de disociación del complejo enzima/herbicida, y;

donde la enzima de HPPD codificada por el polinucleótido seleccionado tiene un valor de kCat/Km de hidroxifenilpiruvato en el intervalo de 0,1 a 5 s'1pM'1 a pH 7,0 y 25 °C.

La presente solicitud también describe tecnología de ADN recombinante y, en particular, la producción de (i) plantas transgénicas que exhiben una resistencia sustancial o una tolerancia sustancial a herbicidas cuando se comparan con plantas similares no transgénicas; y (¡i) plantas transgénicas que contienen niveles relativamente elevados de antioxidantes liposolubles, también cuando se comparan con tales plantas no transgénicas. También se describen las secuencias de nucleótidos (y la expresión de sus productos) cuando se utilizan en la producción de las plantas transgénicas mencionadas o cuando son producidas por estas.

Las plantas que son sustancialmente "tolerantes" a un herbicida cuando se someten al mismo proporcionan una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la proporcionada por plantas semejantes no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen la "dosis" representada en el eje x, y el "porcentaje de exterminio", "efecto herbicida", etc., representado en el eje y. Las plantas tolerantes requerirán típicamente al menos el doble de herbicida que las plantas semejantes no tolerantes a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente "resistentes" al herbicida muestran pocas, si las hay, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo.

Dentro del contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (HPPD), 4-hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (p-OHPP) son sinónimos.

Se conocen métodos para proporcionar plantas que son tolerantes a herbicidas HPPD, que comprenden la transformación del material vegetal con polinucleótidos que comprenden regiones que codifican enzimas de HPPD.

O

Sin embargo, lo que hasta ahora no se ha reconocido generalmente es que diferentes enzimas de HPPD proporcionan diferentes niveles de tolerancia a diferentes herbicidas inhibidores de HPPD. Aunque una enzima de HPPD dada puede proporcionar un nivel útil de tolerancia a algunos herbicidas inhibidores de HPPD, puede ser bastante inadecuada para proporcionar niveles comerciales de tolerancia a un herbicida inhibidor de HPPD diferente más deseable, que, por ejemplo, puede controlar un espectro diferente de malas hierbas, puede ser más barato de obtener, o puede ofrecer beneficios medioambientales. La actual invención proporciona un medio para seleccionar enzimas de HPPD adecuadas para proporcionar niveles comercialmente útiles de resistencia a químicas de herbicidas inhibidores de HPPD particulares.

A fin de proporcionar plantas con tolerancia a tasas de aplicación comercialmente útiles de un herbicida de HPPD deseado, sería una ventaja usar polinucleótidos que codifican enzimas de HPPD que tienen susceptibilidad reducida a la inhibición por el herbicida de HPPD deseado o clase de herbicidas de HPPD. Esta característica de susceptibilidad reducida a la inhibición mediante herbicidas de HPPD in vitro se expresa también aquí como "resistencia incrementada" o "tolerancia inherente".

Se reivindica que algunas formas mutantes de una HPPD de Pseudomonas sp. muestran tal resistencia incrementada en base a mostrar una tasa aparentemente disminuida de unión del inhibidor a la enzima (es decir, en base a medidas que corresponden esencialmente a kon en el equilibrio E + I <> El, véase más arriba). Sin embargo, tales formas enzimáticas mutantes tienen actividad catalítica reducida y/o estabilidad reducida, lo que potencialmente las hacen inadecuadas para uso, especialmente en los cultivos de climas templados, particularmente maíz y haba de soja, para los cuales los herbicidas inhibidores de HPPD proporcionan generalmente el espectro más útil de control de malas hierbas. No se ha conocido hasta ahora que diversas... [Seguir leyendo]

1. Un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que, en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

r2.

R3Vs

V

,RvO

r6 o

o

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, - COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto Rs como Rg son H y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o Ri3, o ambos, son H y Ri4 o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo CrC4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -N02, CF3, -SF5i OR y C02H en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi CrC4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula R.

R3

r4

O N

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo CrC4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi CrC4,

o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula

o

G

O

O

y sus sales agronómicamente aceptables, donde el grupo G se escoge entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente y donde Ri-R2 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

en comparación con herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

y sus sales agronómicamente aceptables, donde los grupos Ar K y J se escogen independientemente entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente, donde los sustituyentes opcionales para los grupos Ky J incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, - S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1-R4 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

donde dicha enzima de HPPD de control se obtiene a partir de una dicotiledónea, particularmente de Arabidopsis o del tabaco;

donde la resistencia de las enzimas de HPPD a herbicidas se determina midiendo la velocidad de disociación del complejo enzima/herbicida, y;

donde la enzima de HPPD codificada por el polinucleótido seleccionado tiene un valor de kcat/Km de hidroxifenilpiruvato en el intervalo de 0,1 a 5 s'1pM'1 a pH 7,0 y 25 °C.

O