Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas.

Un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que,

en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas**Fórmula**

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, - COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto R8 como R9 son H y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o R13, o ambos, son H y R14 o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula**

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R ≥ alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula**Fórmula**

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10178572.

Solicitante: SYNGENTA LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Priestley Road Surrey Research Park Guildford Surrey GU2 7YH REINO UNIDO.

Inventor/es: HAWKES, TIMOTHY, ROBERT, ANDREWS, CHRISTOPHER, JOHN, WARNER,SIMON.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01H5/00 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS.Plantas con flores, es decir, angiospermas.
  • A01M21/04 A01 […] › A01M CAPTURA O CAZA DE ANIMALES, AHUYENTADORES PARA ANIMALES (dispositivos para la captura de enjambres o zánganos A01K 57/00; pesca A01K 69/00 - A01K 97/00; biocidas, pesticidas, productos que atraen o repelen a los animales A01N ); APARATOS DE DESTRUCCION DE ANIMALES O PLANTAS PERJUDICIALES. › A01M 21/00 Aparatos para la destrucción de vegetales indeseables, p. ej. malas hierbas (lucha contra la vegetación indeseable en carreteras o vías férreas E01H 11/00). › Aparatos para la destrucción por medio de vapor, productos químicos, fuego o electricidad.
  • C07K14/415 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/53 C12N 15/00 […] › Oxidorreductasas (1).
  • C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
  • C12N9/02 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
  • C12N9/04 C12N 9/00 […] › actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1).
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

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Fragmento de la descripción:

Hidroxi fenil piruvato dioxigenasas (HPPD) derivadas de plantas y resistentes frente a herbicidas tricetónicos, y plantas transgénicas que contienen estas dioxigenasas

La presente invención se refiere a un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD 5 resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que, en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre 15 fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyeles opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyeles seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto Rs como R9 son H 20 y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o R13, o ambos, son H y RM o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SFs, OR y C02H y en las que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tiene la fórmula R.

r3 r4

O N

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SFs, OR y CO2H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente 30 sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tiene la fórmula

**(Ver fórmula)**

o

**(Ver fórmula)**

G

O

O

y sus sales agronómicamente aceptables, donde el grupo G se escoge entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente y donde Ri-R2 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

en comparación con herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

y sus sales agronómicamente aceptables, donde los grupos Ar K y J se escogen independientemente entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente, donde los sustituyentes opcionales para los grupos Ky J incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, - S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SFs, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1-R4 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-S02R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

donde dicha enzima de HPPD de control se obtiene a partir de una dicotiledónea, particularmente de Arabidopsis o del tabaco;

donde la resistencia de las enzimas de HPPD a herbicidas se determina midiendo la velocidad de disociación del complejo enzima/herbicida, y;

donde la enzima de HPPD codificada por el polinucleótido seleccionado tiene un valor de kCat/Km de hidroxifenilpiruvato en el intervalo de 0,1 a 5 s'1pM'1 a pH 7,0 y 25 °C.

La presente solicitud también describe tecnología de ADN recombinante y, en particular, la producción de (i) plantas transgénicas que exhiben una resistencia sustancial o una tolerancia sustancial a herbicidas cuando se comparan con plantas similares no transgénicas; y (¡i) plantas transgénicas que contienen niveles relativamente elevados de antioxidantes liposolubles, también cuando se comparan con tales plantas no transgénicas. También se describen las secuencias de nucleótidos (y la expresión de sus productos) cuando se utilizan en la producción de las plantas transgénicas mencionadas o cuando son producidas por estas.

Las plantas que son sustancialmente "tolerantes" a un herbicida cuando se someten al mismo proporcionan una curva de dosis/respuesta que está desplazada a la derecha cuando se compara con la proporcionada por plantas semejantes no tolerantes sometidas de forma similar. Tales curvas de dosis/respuesta tienen la "dosis" representada en el eje x, y el "porcentaje de exterminio", "efecto herbicida", etc., representado en el eje y. Las plantas tolerantes requerirán típicamente al menos el doble de herbicida que las plantas semejantes no tolerantes a fin de producir un efecto herbicida dado. Las plantas que son sustancialmente "resistentes" al herbicida muestran pocas, si las hay, lesiones necróticas, líticas, cloróticas u otras lesiones, cuando se someten al herbicida a concentraciones y tasas que se emplean típicamente por la comunidad agrícola para exterminar malas hierbas en el campo.

Dentro del contexto de la presente invención, las expresiones hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (HPPD), 4-hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (4-HPPD) y p-hidroxi fenil piruvato (o ácido pirúvico) dioxigenasa (p-OHPP) son sinónimos.

Se conocen métodos para proporcionar plantas que son tolerantes a herbicidas HPPD, que comprenden la transformación del material vegetal con polinucleótidos que comprenden regiones que codifican enzimas de HPPD.

**(Ver fórmula)**

O

**(Ver fórmula)**

Sin embargo, lo que hasta ahora no se ha reconocido generalmente es que diferentes enzimas de HPPD proporcionan diferentes niveles de tolerancia a diferentes herbicidas inhibidores de HPPD. Aunque una enzima de HPPD dada puede proporcionar un nivel útil de tolerancia a algunos herbicidas inhibidores de HPPD, puede ser bastante inadecuada para proporcionar niveles comerciales de tolerancia a un herbicida inhibidor de HPPD diferente más deseable, que, por ejemplo, puede controlar un espectro diferente de malas hierbas, puede ser más barato de obtener, o puede ofrecer beneficios medioambientales. La actual invención proporciona un medio para seleccionar enzimas de HPPD adecuadas para proporcionar niveles comercialmente útiles de resistencia a químicas de herbicidas inhibidores de HPPD particulares.

A fin de proporcionar plantas con tolerancia a tasas de aplicación comercialmente útiles de un herbicida de HPPD deseado, sería una ventaja usar polinucleótidos que codifican enzimas de HPPD que tienen susceptibilidad reducida a la inhibición por el herbicida de HPPD deseado o clase de herbicidas de HPPD. Esta característica de susceptibilidad reducida a la inhibición mediante herbicidas de HPPD in vitro se expresa también aquí como "resistencia incrementada" o "tolerancia inherente".

Se reivindica que algunas formas mutantes de una HPPD de Pseudomonas sp. muestran tal resistencia incrementada en base a mostrar una tasa aparentemente disminuida de unión del inhibidor a la enzima (es decir, en base a medidas que corresponden esencialmente a kon en el equilibrio E + I <> El, véase más arriba). Sin embargo, tales formas enzimáticas mutantes tienen actividad catalítica reducida y/o estabilidad reducida, lo que potencialmente las hacen inadecuadas para uso, especialmente en los cultivos de climas templados, particularmente maíz y haba de soja, para los cuales los herbicidas inhibidores de HPPD proporcionan generalmente el espectro más útil de control de malas hierbas. No se ha conocido hasta ahora que diversas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para seleccionar un polinucleótido que codifica una enzima de HPPD resistente a herbicidas tricetónicos que comprende cribar una población de secuencias que codifican una enzima de HPPD y seleccionar como secuencias que codifican una enzima de HPPD resistente a tricetonas aquellas secuencias que codifican una enzima que, en comparación con una enzima de HPPD de control tiene al menos una resistencia incrementada 2,5 o, preferiblemente, cuatro veces a herbicidas tricetónicos seleccionados entre herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

r2.

R3Vs

V

,RvO

r6 o

o

**(Ver fórmula)**

y sus sales agroquímicamente aceptables, donde los grupos Ar A, B, D y E se escogen independientemente entre fenilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes opcionales para los grupos A, B, D y E incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, - COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1 o R2, o ambos, son H y tanto R3 como R4 son H y R5 o R6, o ambos, son H, donde tanto Rs como Rg son H y R10 o R11, o ambos, son H, donde R12 o Ri3, o ambos, son H y Ri4 o R15, o ambos, son H y donde R1-R17 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo CrC4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -N02, CF3, -SF5i OR y C02H en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi CrC4;

en comparación con herbicidas seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula R.

R3

r4

O N

**(Ver fórmula)**

y sus sales agronómicamente aceptables, donde R1-R6 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo CrC4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -CO2R, -NO2, CF3, -SF5, OR y CO2H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi CrC4,

o es al menos 2,5 o preferiblemente 4 veces más resistente a herbicidas tricetónicos seleccionados del grupo de herbicidas que tienen la fórmula

o

**(Ver fórmula)**

G

O

O

y sus sales agronómicamente aceptables, donde el grupo G se escoge entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente y donde Ri-R2 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -SO2R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de CrC6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4,

en comparación con herbicidas que tienen una de las siguientes fórmulas

y sus sales agronómicamente aceptables, donde los grupos Ar K y J se escogen independientemente entre fenilo sustituido opcionalmente o heteroarilo sustituido opcionalmente, donde los sustituyentes opcionales para los grupos Ky J incluyen alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, - S02R, NHR-SO2R, -CO2R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de Ci-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4, donde R1-R4 se seleccionan cada uno individualmente del grupo que consiste en alquilo C1-C4, cicloalquilo C3-C6, halógeno, OH, SH, CN, -NH2, -NHCOR, -CONHR, -COR, -SR, SOR, -S02R, NHR-SO2R, -C02R, -N02, CF3, -SF5, OR y C02H, en los que R = alquilo de C1-C6 o arilo opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halo o alcoxi C1-C4;

donde dicha enzima de HPPD de control se obtiene a partir de una dicotiledónea, particularmente de Arabidopsis o del tabaco;

donde la resistencia de las enzimas de HPPD a herbicidas se determina midiendo la velocidad de disociación del complejo enzima/herbicida, y;

donde la enzima de HPPD codificada por el polinucleótido seleccionado tiene un valor de kcat/Km de hidroxifenilpiruvato en el intervalo de 0,1 a 5 s'1pM'1 a pH 7,0 y 25 °C.

**(Ver fórmula)**

O

**(Ver fórmula)**

 

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