Hematoxilina estabilizada.

Composición de hematoxilina estabilizada para la tinción de una muestra de tejido o citológica,

que comprende:

un solvente,

hematoxilina,

una cantidad de un oxidante químico suficiente para convertir por lo menos una parte de la hematoxilina en hemateína,

un mordiente, y

tanto ciclodextrina como hidroquinona.

Hematoxilina estabilizada

La presente invención se refiere a una composición y a un método para la tinción histoquímica de muestras biológicas. Más particularmente, la presente invención se refiere a una formulación de pigmento que se encuentra estabilizada frente a la degradación durante el tiempo, y a la utilización de la formulación para la tinción de muestras biológicas.

Varios protocolos de tinción histoquímica, incluyendo la tinción de hematoxilina y eosina (H-E) y la tinción de Papanicolaou (PAP), se basan en el pigmento hematoxilna para la tinción de muestras citológicas y de tejidos. En particular, la tinción con hematoxilina de los núcleos celulares es utilizada por los patólogos para detectar la presencia de células malignas y/o metastásicas en una muestra de biopsia tumoral.

La hematoxilina es un compuesto de origen natural que se encuentra en el duramen rojo de árboles del género Hematoxylin. La hematoxilina misma es Incolora en solución acuosa y no es el Ingrediente activo que tiñe componentes del tejido. Por el contrario, un producto de oxidación de la hematoxilina, la hemateína, se convierte en el componente de tinción activo de una solución de pigmento hematoxilina, particularmente con el acomplejamiento con un mordiente. La hemateína es producida de manera natural bajo exposición al aire y a la luz solar. El procedimiento natural se denomina "maduración" y puede requerir 3 o más meses proporcionar una solución adecuada para la tinción de las células.

Con el fin de acelerar la conversión de la hematoxilina en hemateína, puede utilizarse un oxidante químico. Desafortunadamente el procedimiento acelerado con frecuencia produce productos de reacción ineficaces, tales como oxihemateína y precipitados poliméricos complejos y proporciona además una solución que se degrada más rápidamente que una solución de tinción madurada naturalmente. La cantidad exacta de oxidante necesaria para oxidar cuantitativamente la hematoxilina en hemateína puede utilizarse para ayudar a evitar la sobreoxidación generadora de productos Ineficaces, aunque más típicamente se utiliza una solución parcialmente oxidada en el caso de que no se lleve a cabo la tinción inmediatamente. En una solución parcialmente oxidada, la oxidación natural de la hematoxilina que queda tras una etapa de oxidación química continuará sustituyendo cualquier hemateína que sea consumida durante la tinción o que continúe oxidándose de manera natural generando productos ineficaces. Sin embargo, la concentración (y cantidad) de la hemateína puede cambiar durante el tiempo.

Debido a que la hemateína es el componente de tinción activo de una solución de hematoxilina, los cambios de su concentración (y/o la concentración de sus complejos de mordiente) durante el tiempo conduce a inconsistencias en la tinción. En un procedimiento de tinción manual, los cambios en el contenido de hemateína de una solución de hematoxilina pueden compensarse alterando el tiempo de contacto de una muestra biológica con la solución basándose en la inspección visual. Por ejemplo, una muestra aparentemente infrateñida puede simplemente volverse a introducir en la solución de hematoxilina durante un periodo de tiempo para incrementar la intensidad de la tinción. Sin embargo, en un procedimiento de tinción automatizado, la inspección "visual" y extensión del tiempo de exposición en respuesta a la infratinción puede requerir costosos equipos de obtención de imágenes y puede trastornar el procesamiento de otras muestras. Por lo tanto, existe una necesidad de una solución de hematoxilina en la que la concentración de hemateína disponible para la tinción sea mejor estabilizada durante el tiempo.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de hematoxilina estabilizada que incluye: un solvente, hematoxilina, una cantidad de un oxidante químico suficiente para convertir por lo menos una parte de la hematoxilina en hemateína, un mordiente y tanto ciclodextrina como hidroquinona. En una realización particular, la solución de hematoxilina estabilizada incluye hematoxilina, agua, un poliol, una cantidad de oxidante suficiente para convertir por lo menos una parte de la hematoxilina en hemateína, un mordiente y tanto ciclodextrina como hidroquinona.

La composición incluye: un solvente, hematoxilina, una cantidad de un compuesto químico y tanto ciclodextrina como hidroquinona. En una realización particular un y tanto ciclodextrina como hidroquinona.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método automatizado para la tinción histoquímica de una muestra biológica. El método incluye poner en contacto la muestra biológica con una composición de hematoxilina dada a conocer y puede incluir además poner en contacto la muestra con una o más composiciones de tinción adicionales, tales como una o más contratinciones. En una realización particular, el método incluye además poner en contacto la muestra con una composición de eosina. En otra realización particular el método está automatizado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de hematoxilina estabilizada que puede utilizarse para la tinción histoquímica. El método incluye formar una solución de hemateína, añadir un mordiente a la solución de hemateína para formar una solución de tinción y añadir tanto ciclodextrina como hidroquinona a la solución de tinción para formar una composición de hematoxilina estabilizada. La solución de hemateína se forma disolviendo hematoxilina en un solvente y después añadiendo un oxidante químico para convertir por lo menos una parte de la hematoxilina en hemateína.

-2-

La fig. 1 es un diagrama de bloques que describe de manera general un protocolo de tinción de H-E automatizado en el que puede incorporarse la composición de hematoxilina dada a conocer.

La fig. 2 es un diagrama que muestra los resultados de estabilidad para varias realizaciones de la composición de hematoxilina dada a conocer.

La fig. 3 es otro diagrama que muestra los resultados de estabilidad para varias realizaciones de la composición de hematoxilina dada a conocer.

La descripción siguiente de varias realizaciones describe ejemplos no limitativos que ¡lustran adicionalmente la invención. Todos los títulos de las secciones contenidas en la presente memoria, incluyendo las que han aparecido anteriormente, no deben interpretarse como limitativas de la invención sino que, por el contrario, se proporcionan a fin de estructurar la descripción ilustrativa de la invención proporcionada por la memoria. Con el fin de ayudar al lector a entender las diversas realizaciones ¡lustradas, se proporcionan explicaciones de términos particulares utilizadas en la descripción, después de las cuales se proporciona una vista general de realizaciones particulares de la invención y ejemplos concretos.

I. Términos:

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los significados comúnmente entendidos por el experto en la materia a la que se refiere la invención dada a conocer.

Las formas singulares "un", "una" y "el" o "ella" incluye los referentes plurales, am neos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un compuesto del huésped" se refiere a uno o más compuestos del huésped, tales como 2 o más compuestos del huésped, 3 o más compuestos del huésped o incluso 4 o más compuestos del huésped.

El término "antioxidante" se refiere a un átomo o molécula que presenta un potencial de oxidación mayor que un segundo átomo o molécula, de manera que el antioxidante preferentemente se oxida en lugar del segundo átomo o molécula. Por ejemplo, un antioxidante puede presentar un potencial de oxidación mayor que el de la hemateína y de esta manera ayudar a evitar la oxidación de la hemateína en oxihemateína. Además, un antioxidante también puede actuar como agente reductor, por ejemplo un agente reductor que convierte la oxihemateína nuevamente en hemateína. Los antioxidantes pueden encontrarse presentes en las composiciones dadas a conocer a concentraciones comprendidas entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 1 M, por ejemplo entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 5 mM, tal como entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 15 mM.

La expresión "solvente acuoso" se refiere a una composición que presenta agua como el componente principal y que es líquida a temperatura ambiente. Las mezclas de agua y uno o más alcanoles o polioles inferiores que presentan un contenido de agua de 5% o superior en volumen son ejemplos de solventes acuosos.

1. Composición de hematoxilina estabilizada para la tinción de una muestra de tejido o citológica, que comprende:

un solvente, hematoxilina,

una cantidad de un oxidante químico suficiente para convertir por lo menos una parte de la hematoxilina en

hematefna,

un mordiente, y

tanto ciclodextrina como hidroquinona.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que el solvente comprende uno o más de entre agua, un alcanol inferior y un poliol.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que el poliol comprende uno o más de entre glicerol, etilenglicol, propilenglicol, poli(etilenglicol) y poli(propilengMcol).

4. Composición según la reivindicación 3, en la que uno o más de entre etilenglicol y propilenglicol comprende entre 1% y 3% en volumen de una composición de solvente acuoso.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el oxidante químico es uno o más de entre yodato sódico, óxido mercúrico, permanganato potásico, peryodato potásico y peróxido de hidrógeno.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el mordiente comprende uno o más de entre un mordiente de aluminio, un mordiente de hierro, un mordiente de bismuto, un mordiente de cobre, un mordiente de molibdeno, un mordiente de vanadio y un mordiente de circonio, en la que el mordiente de aluminio es alúmina o sulfato de aluminio.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un ácido, en la que el ácido comprende ácido acético.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende: una mezcla de agua y etilenglicol como el solvente,

yodato sódico como el oxidante, y sulfato de aluminio como el mordiente,

en la que la proporción molar de hematoxilina a oxidante en la composición es de entre 6:1 y 1:1, y en la que la proporción molar de hematoxilina a mordiente en la composición es de entre 2:1 y 1:1.

9. Método para prepara una composición de hematoxilina estabilizada para la tinción histoquímica de una muestra de tejido o citológica, que o comprende:

formar una solución de hemateína,

añadir un mordiente a la solución de hemateína para formar una solución de tinción, y

añadir tanto ciclodextrina como hidroquinona a la solución de tinción para formar la composición de hematoxilina estabilizada,

en la que la formación de la solución de hemateína comprende: disolver hematoxilina en un solvente, y

añadir una cantidad de un oxidante químico suficiente para convertir por lo menos una parte de la hematoxilnia en hemateína.

1. Método según la reivindicación 9,

en el que el solvente comprende agua y un poliol,

en el que el poliol es uno o más de entre glicerol, etilenglicol y propilenglicol, y

en el que uno o más de entre etilenglicol y propilenglicol comprende entre 1% y 3% en volumen de una composición de solvente acuoso.

11. Método según la reivindicación 9 o 1, en el que el mordiente comprende uno o más de entre un mordiente de aluminio, un mordiente de hierro, un mordiente de bismuto, un mordiente de cobre, un mordiente de molibdeno, un mordiente de vanadio y un mordiente de circonio, en el que el mordiente de aluminio es alúmina o sulfato de aluminio.

12. Método automatizado para la tinción histoquímica de una muestra de tejido o citológica, que comprende poner en contacto la muestra con una composición de hematoxilina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la muestra se soporta sobre un sustrato.

13. Método según la reivindicación 12, que comprende además poner en contacto la muestra con una contratinción, en el que la puesta en contacto de la muestra con una composición de hematoxilina comprende un protocolo de tinción de hematoxilina progresiva o regresiva, el sustrato comprende un portaobjetos de microscopía, y

la contratinción comprende uno o más de entre eosina Y, naranja G, verde pálido SF amarillento, marrón de Bismarck, verde rápido FCF, OA-6, EA25, EA36, EA5 y EA65.