Procedimiento de extracción de compuestos polares.

La presente invención es un procedimiento de extracción de compuestos fenólicos a partir de una muestra no polar o hidrofóbica,

que comprende poner en contacto una cantidad de dicha muestra no polar con una mezcla de disolventes que comprende etanol/agua y 1,4-dioxano, homogeneizar la mezcla obtenida para obtener una emulsión, centrifugar dicha emulsión para obtener una fase no polar y una fase inferior acuosa, y obtención final de la fase acuosa que va a contener los compuestos fenólicos de interés.

PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE COMPUESTOS POLARES CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se encuadra en el sector químico, dentro del área de la química analítica. La preconcentración y extracción de compuestos polares de matrices no polares o hidrofóbicas es de aplicación en la extracción de fenoles en muestras de la industria alimentaria, industria de productos naturales, industria farmacéutica o medicina para el tratamiento de enfermedades crónicas y neurodegenerativas así como enfermedades coronarias y cáncer, puesto que a los compuestos fenólicos se les asocian todas estas propiedades.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Debido a la complejidad de una matriz de naturaleza no polar o hidrofóbica y a la baja concentración en la que se encuentran los compuestos fenólicos en algunos casos, el desarrollo de procedimientos simples y fiables para su extracción y preconcentración no se ha conseguido en la técnica de forma satisfactoria.

Se han propuesto diferentes procedimientos siendo los más ampliamente empleados los de extracción líquido-líquido con mezclas hidroalcohólicas en distintas proporciones, también conocidos como LLE (Liquid-Liquid Extraction), y los de extracción en fase sólida también conocido como SPE (Solid Phase Extraction ) con cartuchos Diol (Ouni Y. et al. "Characterisation and quantification of phenolic compounds of extra-virgin olive oils according to their geographical origin by a rapid and resolutive LC-ESI-TOF MS method", 2011, Food Chem. 127; 1263-1267).

Los principales inconvenientes de estos procedimientos son la gran cantidad de tiempo y de disolventes tóxicos que se requieren. Para salvar estos inconvenientes se han ideado procedimientos de microextracción que derivan de los anteriores. Un ejemplo de ello es la la microextracción dispersiva líquido-líquido, también conocida como DLLME (Dispersive Liquid-Liquid Microextr action) de Rezaee (Rezaee M. et al., "Determination of organic compounds in water using dispersive liquid-liquid microextraction", 2006, J. Chromatogr. A 1116; 1-9). La DLLME se puede considerar como una versión miniaturizada de la LLE, basada en el equilibrio de distribución del analito de interés entre la disolución de la muestra y el disolvente extractante, y que requiere volúmenes de disolventes orgánicos del orden de microlitros.

Las principales ventajas de los procedimientos de microextracción con respecto a los de LLE y de SPE son la disminución en el volumen de disolventes empleados, un tiempo de extracción menor como consecuencia del rápido alcance del estado de equilibrio, alto factor de enriquecimiento a consecuencia de la alta relación de fase, la simplicidad de operación, necesidad de poca cantidad de muestra y bajo coste.

La DLLME convencional consiste en la formación de un sistema ternario de disolventes constituido por la muestra acuosa que contiene los analitos, un disolvente extractante hidrofóbico de mayor densidad que la muestra y un disolvente dispersante hidrofílico, que actúa de "puente", puesto que a su vez es miscible con el disolvente extractante.

Cuando se utiliza DLLME convencional se emplean disolventes orgánicos para llevar a cabo la extracción de los analitos de interés de una muestra acuosa. Sin embargo, una fase extractante orgánica no suele ser compatible por ejemplo con un sistema de separación por cromatografía en fase inversa, por lo que en la mayoría de los casos se tiene que llevar a cabo la evaporación del disolvente extractante y la reconstitución en un disolvente compatible con el sistema de separación y/o determinación.

Hashemi aplicó la DLLME a la determinación de oleuropeína en aguas residuales procedentes del procesamiento de las aceitunas y en extractos de las hojas del olivo (Hashemi P. et al. "Reversed-phase dispersive liquidliquid microextraction with central composite design optimization for preconcentration and HPLC determination of oleuropein", 2010, Talanta 80; 1926-1931). El procedimiento comprende una primera extracción con acetato de etilo en ambas materias primas. A continuación, mezclar este extracto con agua a pH ligeramente ácido que actuó como disolvente extractante e inyectar esta mezcla en ciclohexano. Tras la formación de la emulsión y la correspondiente centrifugación para la separación de las fases recogieron la fase acuosa inferior. Después de la primera extracción de la muestra acuosa con acetato de etilo los autores siguen con un procedimiento que denominan RP-DLLME (Reverse Phase-DLLME). Sin embargo, si se atiende al carácter polar de las muestras de las se parte, esta denominación no es del todo correcta, ya que el procedimiento se aplica en origen en una muestra polar, de la que se obtienen los componentes de interés aplicando dicha extracción previa con dicho acetato de etilo.

El procedimiento se aplicó también a la extracción y determinación de los alcoholes fenólicos tirasol e hidroxitirosol en muestras de aceite de oliva virgen (Hashemi P. et al. "Reversed-Phase Dispersive Liquid-Liquid Microextraction with Multivariate Optimization for

sensitive HPLC Determination of Tyrosol and Hydroxytyrosol in Olive Oil", 2011, Anal Sci 27; 943-947). En aceite de oliva virgen disuelto en ciclohexano añadieron acetato de etilo como disolvente dispersante y agua a pH básico como extractante, para recoger la fase. Esta publicación se considera el documento más cercano de la técnica. El inconveniente principal de este procedimiento es que no consigue evitar el uso de ciclohexano o hexano en el procedimiento, que son disolventes tóxicos y contaminantes.

Utilizar además un medio básico como disolvente extractante es también un inconveniente. Se ha descrito que la extracción de los compuestos fenólicos se favorece cuando se emplea medio ácido o neutro, pero en ningún caso básico, puesto que en medio básico pueden tener lugar reacciones de hidrólisis de los compuestos fenólicos. Para conseguir la extracción del mayor número de compuestos fenólicos habría que evitar además las reacciones de oxidación de los compuestos fenólicos con grupos hidroxilo en posición orto, favorecidas por el medio básico. La presente invención evita el medio básico en el disolvente extractante consiguiendo así la máxima eficiencia en la extracción (Zafra A. et al. "Determination of polyphenolic compounds in wastewater olive oil by gas chromatography- mass spectrometry", 2006, Talanta. 213-218).

La presente invención supone un procedimiento mejorado a la DLLME sobre muestras hidrofóbicas.

El problema de la técnica es por tanto encontrar un método de extracción de compuestos fenólicos a partir de muestras hidrofóbicas que evite el empleo de disolventes tóxicos. La solución propuesta en la presenta invención es inyectar una mezcla formada por etanol/agua como disolvente extractante y 1,4-dioxano como disolvente dispersante.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento para la extracción de compuestos fenólicos y polares de muestras no polares o hidrofóbicas mediante la utilización de un procedimiento de microextracción dispersiva líquido-líquido en fase inversa (RP-DLLME).

La invención es un procedimiento de extracción de compuestos fenólicos a partir de una muestra no polar o hidrofóbica, que comprende:

a) poner en contacto una cantidad de dicha muestra no polar con una mezcla de disolventes que comprende etanol/agua en una proporción de entre 50:50 y 70:30 v/v, preferiblemente 60:40 v/v, y 1,4-dioxano,

b) homogeneizar dicha mezcla obtenida en el paso a) para obtener una emulsión,

c) centrifugar la emulsión del paso b) para obtener una fase no polar y una fase inferior acuosa,

d) recuperar la fase acuosa obtenida en el paso c).

En una realización preferible, la cantidad de etanol/agua es de entre 120 y 170 pl, más preferiblemente aún 150 p. En una realización preferible más, la cantidad de 1,4-dioxano es de entre 900 y 1100 pl, más preferiblemente aún 1000 pl.

En la mezcla de disolventes, el etanol/agua actúa como disolvente extractante y el 1,4- dioxano como disolvente dispersante.

El disolvente extractante es el parámetro que más influencia tiene en el procedimiento. Debe poseer densidad mayor que la muestra para hacer posible su separación por centrifugación, buena capacidad de extracción de los compuestos de interés y baja solubilidad en la muestra.

El disolvente dispersante debe ser miscible tanto con la muestra como con el disolvente extractante para permitir la dispersión de éste último formando una emulsión de muestra / disolvente dispersante / disolvente extractante.

El hecho de evitar etapas con disolventes tóxicos y necesitar un volumen muy pequeño de disolvente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de extracción de compuestos fenólicos a partir de una muestra no polar o hidrofóbica, caracterizado por que comprende:

a) poner en contacto una cantidad de dicha muestra no polar con una mezcla de disolventes que comprende etanol/agua en una proporción entre 50:50 y 70:30 v/v y 1,4-dioxano,

b) homogeneizar la mezcla obtenida en el paso a) para obtener una emulsión,

c) centrifugar la emulsión del paso b) para obtener una fase no polar y una fase inferior acuosa,

d) recuperar la fase acuosa obtenida en el paso c).

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en que la cantidad de etanol/agua es de entre 120 y 170 pl.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en que la cantidad de 1,4-dioxano es de

entre 900 y 1100 pl.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, en que la proporción de etanol / agua es de 60:40 v/v.