Estabilización de partículas virales.

Método para conservar partículas virales que comprende:

(a) proporcionar una solución acuosa de (i) partículas virales de Adenoviridae,

Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae o Poxviridae, (ii) uno o más azúcares, y (iii) una N,Ndi( alquilo C1-6)-glicina o N,N, N-tri(alquilo C1-6)-glicina, o una sal o éster fisiológicamente aceptable de la misma; y

(b) desecar la solución para formar una composición que incorpora dicho virus.

Estabilización de partículas vírales Área de la invención

La presente invención hace referencia a la estabilización de partículas virales.

Antecedentes de la invención

Algunas moléculas biológicas son suficientemente estables, de tal manera que pueden ser aisladas, purificadas y a continuación almacenadas en solución a temperatura ambiente. Sin embargo, esto no es posible para muchos materiales, y por esta razón se han intentado técnicas que implican almacenaje a baja temperatura, adición de estabilizadores o crioprotectores, liofilización, desecación al vacío y secado al aire para asegurar la conservación durante el almacenamiento.

A pesar de la disponibilidad de estas técnicas, algunos materiales biológicos aún muestran niveles insatisfactorios de estabilidad durante el almacenamiento, y algunas técnicas acarrean inconvenientes y costes añadidos. Por ejemplo, el transporte y el almacenamiento refrigerado resulta costoso, y cualquier ruptura en el control de la temperatura puede dar como resultado una reducción de la eficacia de la molécula biológica. Además, el transporte refrigerado a menudo no está disponible durante el transporte de medicinas en países en vías de desarrollo.

Además, las tensiones de la cñodesecación o liofilización pueden ser muy petjudiciales para algunos materiales biológicos. La liofilización de medicamentos biológicos implica la congelación de soluciones o suspensiones de biomateñales termosensibles, seguido de desecación primaria y secundada. La técnica está basada en la sublimación del agua a temperaturas bajo cero en vacío sin fusión de la solución. La liofilización representa una etapa clave para la fabricación de productos farmacéuticos de proteínas sólidas y vacunas. La tasa de difusión de vapor de agua del biomatenal congelado es muy baja y por lo tanto, el proceso consume mucho tiempo. Adicionalmente, tanto la etapa de congelación como la de desecación introducen tensiones que son capaces de desdoblar o desnaturalizar las proteínas.

La patente WO 90/05182 describe un método para proteger las proteínas contra la desnaturalización durante la desecación. El método comprende las etapas de mezclar una solución acuosa de la proteína con un polielectrolito catiónico y poliol cíclico y eliminar el agua de la solución. Dietilaminoetil-Dextrano (DEAE-dextrano) y chitosán son los polielectrolitos catiónicos preferidos, aunque la polietilenimina se menciona también como adecuada.

La patente WO-A-2006/0850082 describe un producto desecado o conservado que comprende un azúcar, un material cargado tal como una proteína de histona y un componente biológico termosensible o de desecación. El azúcar forma una matriz de sólido amorfo. Sin embargo, la histona puede tener consecuencias inmunológicas si el componente biológico conservado se administra a humanos o animales.

La patente WO 2008/114021 describe un método para conservar partículas virales. El método comprende desecar una solución acuosa de uno o más azúcares, una polietilenimina y las partículas virales para formar una matriz de sólido amorfo que comprende las partículas virales. La solución acuosa contiene polietilenimina a una concentración de 15mM o menos en base a la masa molecular media numérica (Mn) de la polietilenimina y la concentración de azúcar o, si está presente más de un azúcar, la concentración de azúcar total es mayor de 0,1 M.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han observado que las preparaciones virales se conserva de manera estable mediante una N,N-di(alquilo Ci-C6)-glicina o N,N,N-tri(alquilo Ci-C6)-glicina, o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma, y uno o más azúcares durante la desecación. La actividad vírica se conservó después de una prueba de exposición térmica posterior. La actividad vírica se conservó también durante pruebas de estabilidad a largo plazo. La actividad vírica puede también ser conservada en solución acuosa previamente a la desecación. Los virus fueron protegidos contra daños causados por congelación, liofilización y descongelación.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para conservar partículas virales que comprende:

(a) proporcionar una solución acuosa de (i) partículas virales de Adenov/'r/'dae, Orfñomyxov/r/dae, Paramyxow'r/'dae, Parvov/r/dae, P/'comav/'r/'dae o Poxv/'r/'dae, (ii) uno o más azúcares, y (i¡¡) una N,N-di(alquilo Ci-6)-glicina o N,N,N- tri(alquilo Ci-6)-glicina, o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma; y

(b) desecar la solución para formar una composición que incorpora dicho virus.

La invención además comprende:

- una composición que se encuentra sóiida y iiofiiizada y comprende una N,N-di(aiquiio Ci^)-giicina o N,N,N- tri(aiquiio Ci.6)-gücina o una sai o áster fisioiógicamente aceptabie de ia misma y uno o más azúcares, y que incorpora partícuias viraies de Adenov/r/dae, Orfhomyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Parvov/ndae, P/cornav/r/dae o Poxv/r/dae;

- una vacuna que comprende una composición de ia invención que incorpora partícuias viraies no infecciosas y opcionaimente un adyuvante;

- un método para ia preparación de una vacuna que incorpora partícuias viraies, método que comprende:

(a) proporcionar una soiucíón acuosa de (i) partícuias viraies de Adenov/r/dae, Orfñomyxov/ndae, Paramyxov/r/dae, Parvov/ndae, P/comav/r/dae o Poxv/ndae, (ü) una N,N-di(aiquiio Ci.6)-giicina o N,N,N- tri(aiquiio Ci^)-güc¡na o una sai o áster fisioiógicamente aceptabie de ia misma y (iii) uno o más azúcares; y

(b) añadir opcionaimente un adyuvante, tampón, antibiótico y/o aditivo a ia mezcia; y

(c) desecar ia soiucíón para formar una composición o composición sóiida que incorpore dichas partícuias viraies;

- una composición o poivo seco que comprende partícuias viraies o partícuias viraies no infecciosas de Adenovíndae, Orfñomyxov/ndae, Paramyxov/r/dae, Parvov/r/dae, P/comav/ncfae o Poxv/r/dae y que se puede obtener mediante un método de ia invención; y

- uso de una N,N-di(alquilo Ci-6)-giicina o N,N,N-tri(aiquiio Ci^)-gl¡c¡na o una sai o áster fisioiógicamente aceptabie de la misma y uno o más azúcares para conservar partícuias vírales de Adenov/r/dae, Orf/iomyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Pan/ow'r/'dae, P/comav/r/dae o Poxw'r/'dae.

Breve descripción de las Figuras

La figura 1 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo de referencia 1. Se evaluó ia capacidad de un excipiente para ayudar al adenovirus a resistir una variación cíclica entre 37°C y -20°C. Se utilizó dimetüsuifona (también denominada metilsulfonilmetano, MSM) como excipiente. Resumen del valor de p: **=p<0,01, *=p<0,05. Las barras de error muestran el error estándar de la media (n = 4).

La figura 2A muestra la temperatura establecida para la temperatura de almacenamiento del liofilizador VirTis Advantage utilizado en varios de los Ejemplos.

La figura 2B muestra la temperatura del condensador del liofilizador VirTis Advantage utilizado en varios de los Ejemplos.

La figura 3 muestra los resultados del experimento del Ejemplo de referencia 2 que investigó el efecto de los azúcares y el MSM sobre la conservación de adenovirus durante la liofilización. Las barras de error mostradas son el error estándar de la media (n = 3).

La figura 4 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 3 de la infectividad del adenovirus analizada inmediatamente después de la descongelación, además de la de aquellas muestras liofilizadas después de la formulación con TMG (trimetilglicina) con o sin azúcares. La actividad adenoviral se expresó como pfu/ml, tal como se evaluó mediante el conteo de células positivas para la expresión de GFP. Las barras de error mostradas son el error estándar de la media (n = 3).

La figura 5 demuestra las condiciones de liofilización utilizadas en el Ejemplo de referencia 4.

La figura 6 muestra los gráficos de barra que demuestran los títulos de virus de muestras reconstituidas utilizadas en el Ejemplo de referencia 4 a continuación de la prueba de exposición térmica a 4°C o 37°C durante 7 días. También se muestra el título de partida del virus de entrada. Las barras de error representan el error estándar de la media (n=3).

La figura 7 muestra los resultados obtenidos en el Ejemplo 5 para muestras de adenovirus que se sometieron a prueba inmediatamente después de la descongelación ("Pre-L/o/i'//zac/ón"), además de los de las muestras que fueron formuladas en PBS (solución tampón de fosfatos) a concentraciones de DMG de 0,00M, 0,07M, 0,23M y 0,70M, con o sin azúcares y que son posteriormente liofilizadas.... [Seguir leyendo]

1. Método para conservar partículas virales que comprende:

(a) proporcionar una solución acuosa de (i) partículas virales de /tdenow'r/'dae, Orfhomyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Pan/ow'n'dae, P/comav/r/dae o Poxv/r/dae, (ii) uno o más azúcares, y (i¡¡) una N,N- di(alquilo Ci-6)-glicina o N,N,N-tri(alquilo Ci.6)-glicina, o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma; y

(b) desecar la solución para formar una composición que incorpora dicho virus.

2. Método según la reivindicación 1 en el que el compuesto (iii) es

(a) N,N-d¡met¡lgl¡cina o N,N,N-trimet¡lgl¡c¡na, o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma;

(b) N,N-d¡met¡lgl¡cina o N,N,N-trimetilgl¡c¡na o una sal clorhidrato de la misma; o

(c) N,N-d¡met¡lgl¡cina o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma

3. Método según la reivindicación 1 o 2 en donde:

(a) la concentración de N,N-di(alquilo Ci.6)-glicina o N,N,N-tri(alquilo Ci-6)-glicina o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma es de 0,1mM a 2,5M, y la concentración de azúcar o, si más de un azúcar está presente, la concentración de azúcar total es de al menos 0,01 M;

(b) la concentración de N,N-di(alquilo Ci-6)-glicina o N,N,N-tri(alquilo C^-glicina o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma es de 0,1 mM a 3M; o

(c) la concentración de N,N-di(alquilo Ci^)-glicina o N,N,N-tri(alquilo C^-glicina o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma es (i) de 0,001 M a 2,5M, de 0,01 M a 2,5M o de 0,1 M a 2M, o (¡i) de 7mM a 1,5M o de 0,07M a 0,7M, o (iii) de 7mM a 1,5M o 0,07M a 1M, o (iv) de 005M a 2M, de 0,02M a 2M o de 0,07M a 1M.

4. El método según la reivindicación 1 en donde la solución acuosa además comprende un compuesto de la fórmula (II) o una sal fisiológicamente aceptable de la misma

B X representa -S(0)2- o -S*(Rc)-;

B Ra y Rb representan independientemente alquilo Ci^; y

B Re representa alquilo C1-6 sustituido con un anión carboxilado y con una fracción amina (-NH2).

5. Método según la reivindicación 4 en donde el compuesto de la fórmula (II) es un compuesto de sulfona de la fórmula (HC):

(II)

en donde:

(IIC)

en donde Ra y Rb representan independientemente alquilo C1.6.

6. Método según la reivindicación 5 en donde:

(a) la concentración de N,N-di(alquilo Ci-6)-glicina o N,N,N-tri(alquilo Ci.6)-glic¡na o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma en dicha solución acuosa es de 0,1 a 1,5M, y/o

(b) el compuesto de sulfona de la fórmula (IIC) es metilsulfonilmetano, y/o

(c) la concentración del compuesto de sulfona de la fórmula (IIC) en dicha solución acuosa es de 0,1 a 1,5M.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en las que:

(i) (a) la concentración de azúcar, o la concentración total de azúcar, es de 0,1M a 3M o 0,2M a 2M, (b) la solución para la desecación comprende uno o más azúcares en una concentración, o concentración total de azúcar si se encuentra presente más de un azúcar, de al menos 0,1 M, o (c) la concentración de azúcar de la solución acuosa es de 0,05 a 1M; y/o

(ii) La solución acuosa comprende un azúcar no reductor o un alcohol de azúcar; y/o

(iii) dos o más azúcares se utilizan y uno de los azúcares es sacarosa; y/o

(iv) dos o más azúcares se utilizan, uno de los azúcares es sacarosa y la relación de la concentración de sacarosa en relación al otro azúcar o azúcares es de 1:1 a 20:1; y/o

(v) la solución para la desecación comprende manltol; y/o

(vi) está presente un azúcar que es manltol o están presentes dos azúcares que son sacarosa y rafinosa;

y/o

(vii) la solución acuosa comprende sacarosa o manltol; y/o

(viii) (a) la solución acuosa es liofilizada, o (b) la solución acuosa es llofillzada o desecada por pulverización, o (c) la solución acuosa es liofilizada en viales o ampollas que se sellan a continuación.

8. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que

(a) las partículas virales están compuestas de un virus vivo o un virus muerto; y/o

(b) las partículas virales están compuestas de un virus vivo o un virus muerto, y el virus vivo es un virus completo o un virus vivo atenuado; y/o

(c) el virus se selecciona de un adenovirus, virus vaccinia, virus de la gripe o virus del sarampión.

9. Composición que es sólida y liofilizada y comprende N,N-di(alquilo C^-glicina o N,N,N-tri(a!quüo C^-glicina o una sal o áster fisiológicamente aceptable de la misma y uno o más azúcares, y que incorpora partículas virales procedentes de TSdenow'r/'dae, Orf/?omyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Pan/ow'r/'dae, P/cornav/r/dae o Poxv/r/dae.

10. Composición según la reivindicación 9: (a) que comprende un azúcar no reductor o alcohol de azúcar, y/o (b) en donde se encuentra presente un azúcar que es sacarosa o manitol, o se encuentran presentes dos azúcares que son sacarosa y rafinosa.

11. Composición según se define en ia reivindicación 9 o 10 para su uso como vacuna en ia profiiaxis o tratamiento de toxicidad inducida por virus, infección virai, secueias de una infección virai, cáncer o aiergia; o en terapia génica o ei tratamiento de una enfermedad autoinmune.

12. Una vacuna que comprende una composición según se define en ia reivindicación 9 o 10 que incorpora 5 partícuias viraies no infecciosas y opcionaimente un adyuvante.

13. Método de preparación de una vacuna que incorpora partícuias viraies, cuyo método comprende:

(a) proporcionar una soiución acuosa de (i) partícuias viraies de /Sdenov/r/dae, Orf/iomyxov/n'dae, Paramyxov/r/dae,

Parvov/r/dae, P/cornav/r/dae o Poxv/r/dae, (¡i) una N,N-di(aiquiio Ci^)-glicina o N,N,N-tri(aiquiio Ci-6)-giicina 10 o una sai o ésterfisioiógicamente aceptabie de ia misma y (iii) uno o más azúcares; y

(b) opcionaimente añadir un adyuvante, tampón, antibiótico y/o aditivo a ia mezcia; y

(c) desecar ia soiución para formar una composición o composición sóiida que incorpora dichas partícuias viraies.

14. Composición o poivos secos que comprende partícuias viraies o partícuias viraies no infecciosas procedentes de 15 /Sdenov/'r/'dae, Ofí/iomyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Parvov/r/dae, P/cornav/r/dae o Poxv/r/dae y que se obtiene

mediante un método según se define en cuaiquiera de ias reivindicaciones 1 a 8 o 13.

15. Uso de una N,N-di(alquilo Ci-6)-giicina o N,N,N-tñ(aiquiio Ci-6)-giicina o una sai o áster fisioiógicamente aceptable de la misma y uno o más azúcares para conservar partícuias viraies procedentes de /4denov/r/dae, Orfñomyxov/r/dae, Paramyxov/r/dae, Pan/ow'r/'dae, P/'comaw'r/'dae o Poxv/r/dae.