Disolución acuosa para conservación de células.

Una disolución acuosa para conservación de células, que comprende las siguientes composiciones (a) a (e) y que tiene un pH de 6,

5 a 9,0:

(a) 5,0 a 12,0 % p/v de un crioprotector;

(b) 3,0 a 5,0 % p/v de un azúcar;

(c) 0,1 a 1,0 % p/v de un espesante;

(d) 0,01 a 1,0 % p/v de un ajustador de pH y

(e) una cantidad apropiada de agua;

estando la disolución acuosa exenta de componentes de origen animal naturales.

Disolución acuosa para conservación de células.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una disolución acuosa para conservación de células capaz de conservar células durante un largo tiempo por una simple operación y más específicamente, a una disolución acuosa para conservación de células sin componente de origen animal natural tal como un medio basal o suero.

Técnica anterior

Convencionalmente, se ha realizado crioconservación para evitar el deterioro celular de células cultivadas con pases sucesivos y contaminación por gérmenes a fin de que se puedan utilizar las células durante largo tiempo. Como tal método general para conservación de células se conoce un método de conservación de células en nitrógeno líquido (-196°C) por: suspensión de las células en un medio de cultivo que contiene sulfóxido de dimetilo (de ahora en adelante referido como DMSO) y suero; dispensación de la suspensión en un criotubo o una ampolla y enfriamiento de la suspensión con un congelador programado.

Se han preparado diversas composiciones de disoluciones de conservación para crioconservación dependiendo de los tipos de células que se tienen que conservar. Por ejemplo, se ha desarrollado un medio de cultivo sin suero para crioconservación para células cultivadas que se tienen que cultivar en un medio de cultivo sin suero (véase, por ejemplo, el Documento de Patente 1). Además, una disolución para crioconservación varía en calidad debido a diferentes lotes de suero. Además, los componentes esencialmente innecesarios para la conservación de células, tales como diversas clases de citocinas, factores de crecimiento y hormonas contenidos en el suelo pueden cambiar la propiedad de las células conservadas, así se han desarrollado disoluciones para crioconservación sin usar suero (véase, por ejemplo, el Documento de Patente 2).

Sin embargo, la disolución de crioconservación sin suero descrita en el Documento de Patente 1 incluye un medio basal que contiene una variedad de componentes. Por ejemplo, un medio de cultivo RPMI1640 contiene un gran número de aminoácidos no definidos de origen. La influencia de esos componentes del medio de cultivo sobre las células conservadas es también desconocida. Además, se usa albúmina purificada en el Documento de Patente 2. Sin embargo, podía estar contaminada por diversos componentes dependiendo del grado de refinamiento de la albúmina, así permanecen los problemas que conciernen a influencias sobre las células.

Considerando las potenciales influencias sobre las células que se tienen que conservar en disolución que contiene suero o medio basal, especialmente para uso médico, se desea el desarrollo de una disolución de conservación de células bien definida químicamente exenta de componentes de origen animal naturales. Dicha disolución de conservación de células incluye componentes definidos de origen y así se puede esperar que presente la ventaja de que se mantenga constante la calidad de la disolución.

Desafortunadamente, la disolución de conservación de células convencional requiere medio basal, suero o sustitución de suero, tal como albúminas de suero, albúminas purificadas y similares para realizar conservación de células a largo plazo y estable. Por lo tanto, una disolución de conservación de células que esté totalmente exenta de componente de origen animal natural aún no ha sido obtenido.

Documento de Patente 1: patente japonesa JP 63-216476A

Documento de Patente 2: patente japonesa JP 2002-233356 A

Descripción de la invención

Probiema que se tiene que resoiver mediante ia invención

Es un objeto de la presente invención proporcionar una disolución acuosa para conservación de células exenta de componente de origen animal, natural, tal como un medio basal o suero. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para conservación de células usando la disolución de conservación acuosa.

Medios para resolver los problemas.

Como resultado de estudios extensos para resolver los problemas anteriores, los autores de la presente invención han completado finalmente la presente invención mediante el descubrimiento de una disolución de conservación acuosa que permite que las células después de la conservación muestren una alta tasa de supervivencia por ajuste de otros componentes y sus concentraciones excluyendo cualquier componente de origen animal, natural, tal como un medio basal o suero. Además, los autores han completado un método para conservación de células mediante la preparación de células con la disolución de conservación acuosa de la presente invención.

La presente invención se refiere a un método para conservación de células usando una disolución acuosa para conservación de células de acuerdo con uno cualquiera de los siguientes artículos (4) a (17), en el que la disolución

acuosa está exenta de componentes de origen animal, naturales:

(4) una disolución acuosa para conservación de células que contiene las siguientes composiciones (a) a (e) y que tiene un pH de 6,5 a 9,0:

(a) 1,0 a 20,0 % p/v de un crioprotector;

(b) 1,0 a 10,0 % p/v de azúcares;

(c) 0,1 a 1,0 % p/v de un espesante;

(d) 0,01 a 1,0 % p/v de un ajustador de pH y

(e) una cantidad apropiada de agua;

(5) una disolución acuosa para conservación de células de acuerdo con el artículo (4), en que una presión osmótica es 1.000 mOsm o más;

(6) una disolución acuosa para conservación de células según el artículo (5) anterior, en que la presión osmótica es 1.000 a 2.700 mOsm;

(7) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos (4) a (6), en que el espesante es carboxlmetllcelulosa (CMC), carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na) o un polímero de ácido orgánico;

(8) una disolución acuosa para conservación de células según los artículos anteriores (7), en que el polímero de ácido orgánico es pollacrllato de sodio;

(9) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (8), en que el crioprotector es sulfóxldo de dlmetllo (DMSO, por sus siglas en inglés) o propilenglicol;

(10) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (9), en que el azúcar es glucosa;

(11) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (10), en que el ajustador de pH es un tampón de fosfato;

(12) una disolución acuosa para conservación de células que contiene las siguientes composiciones (a) a (e) y que tiene un pH de 6,5 a 9,0:

(a) 5,0 a 12,0% p/v de DMSO;

(b) 3,0 a 5,0 % p/v de glucosa;

(c) 0,2 a 0,7 % p/v de un espesante;

(d) 0,01 a 1,0 % p/v de un tampón de fosfato y

(e) una cantidad apropiada de agua;

(13) una disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de los artículos anteriores (4) a (12), en que las células que se tienen que conservar son cualquiera de: linfocitos, células del bazo, timocitos, células animales, células madre somáticas y células madre embrionarias;

(14) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (13), usándose la disolución para aplicaciones médicas;

(15) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (14), en que el método para conservación de células es crioconservación;

(16) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (15), en que la tasa de supervivencia de las células después de la conservación es al menos 80%;

(17) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (15), en que la capacidad de proliferación de las células se mantiene después de conservación durante 4 días a -80 °C y después de 72 días a -196 °C y

(18) una disolución acuosa para conservación de células según uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (15), en que la capacidad de diferenciación de las células después de la conservación se mantiene.

(19) un método para conservación de células Incluyendo: dispersar las células en la disolución acuosa para conservación de las células de acuerdo con uno cualquiera de los artículos anteriores (4) a (15); dispensar las

células en envases y someter las células a crloconservaclón o

(20) un método para conservar las células de acuerdo con el artículo (19)... [Seguir leyendo]

1. Una disolución acuosa para conservación de células, que comprende las siguientes composiciones (a) a (e) y que tiene un pH de 6,5 a 9,0:

(a) 5,0 a 12,0 % p/v de un crloprotector;

(b) 3,0 a 5,0 % p/v de un azúcar;

(c) 0,1 a 1,0 % p/v de un espesante;

(d) 0,01 a 1,0 % p/v de un ajustador de pH y

(e) una cantidad apropiada de agua;

estando la disolución acuosa exenta de componentes de origen animal naturales.

2. La disolución acuosa para conservación de células según la reivindicación 1, en la que una presión osmótica es

1.000 mOsm o más.

3. La disolución acuosa para conservación de células según la reivindicación 2, en la que la presión osmótica es

1.000 a 2.700 mOsm.

4. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el espesante comprende carboxlmetllcelulosa (CMC), carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na) o un polímero de ácido orgánico.

5. La disolución acuosa para conservación de células según la reivindicación 4, en la que el polímero de ácido orgánico comprende pollacrllato de sodio.

6. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el crioprotector comprende dlmetllsulfóxldo (DMSO) o propllengllcol.

7. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el azúcar comprende glucosa.

8. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el ajustador de pH comprende un tampón de fosfato.

9. La disolución acuosa para conservación de células según la reivindicación 1, que comprende las siguientes composiciones (a) a (e):

(a) 5,0 a 12,0 % p/v de DMSO;

(b) 3,0 a 5,0 % p/v de glucosa;

(c) 0,2 a 0,7 % p/v de un espesante;

(d) 0,01 a 1,0 % p/v de un tampón de fosfato y

(e) una cantidad apropiada de agua.

10. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además células que se tienen que conservar, en la que las células que se tienen que conservar comprenden cualquiera de llnfocltos, células de bazo, timocitos, células animales, células madre somáticas, células madre mesenqulmales y células madre embrlónicas no humanas.

11. La disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para uso en aplicaciones médicas.

12. Uso de una disolución acuosa para conservación de células según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 como un crioprotector.

13. Un método para conservación de células, que comprende: dispersar células en la disolución acuosa para conservación de células de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; dispensar las células en envases y someter las células a crioconservaclón.

14. El método para conservación de células según la reivindicación 13, en el que el número de las células dispensadas es 1x10^ a 1 x10^ células/ml.