Armazón proteico.

Un armazón polipeptídico recombinante que comprende:

I. siete dominios de cadena beta designados A,

B, C, D, E, F y G;

II. unidos a seis regiones de bucle, en las que una región de bucle conecta cada cadena beta y se designa bucle AB, BC, CD, DE, EF y FG;

III. en el que al menos una región de bucle varía por deleción, sustitución o adición de al menos un aminoácido de las regiones de bucle de SEC ID Nº: 1; y

IV. en el que dicho armazón comprende al menos un enlace disulfuro para unir dos cualesquiera de dichos sietes dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta del tercer dominio de Fibronectina III de tenascina C, Tn3SS3 (SEC ID Nº: 65), o Tn3SS4 (SEC ID Nº: 66); o en el que dicho armazón comprende al menos dos enlaces disulfuro para unir dos cualesquiera de dichos siete dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta de Tn3SS3+4 (SEC ID Nº: 67).

Armazón proteico

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a armazones proteicos que se unen específicamente a diana y a métodos para preparar, explorar y usar dichos armazones.

2. Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a armazones proteicos útiles, por ejemplo, para la generación de productos que tengan nuevas características de unión.

Como reactivos para el diseño de productos modificados técnicamente pueden usarse proteínas que tienen estructuras tridimensionales relativamente definidas, que normalmente reciben el nombre de armazones proteicos. Estos armazones contienen típicamente una o más regiones sensibles a variación de secuencia específica o al azar, y dicha distribución de secuencia al azar se lleva a cabo con frecuencia para producir bibliotecas de proteínas a partir de las cuales pueden seleccionarse productos deseados. Un área particular en el que dichos armazones son útiles es en el campo del diseño de miméticos de anticuerpos.

Aunque en el comercio se conocen anticuerpos terapéuticos con algunos ejemplos satisfactorios (HERCEPTIN®, AVASTIN®, SYNAGIS®), hay un creciente interés en la generación de fragmentos de anticuerpo como proteínas terapéuticas. Las ventajas son la facilidad de realizar la manipulación mediante técnicas de biología molecular para obtener características de unión deseadas, la capacidad de expresar dichos fragmentos en sistemas microbianos, y la expectativa de que los fragmentos de anticuerpo tengan mejor penetración tisular que los anticuerpos de longitud completa. Un ejemplo es REOPRO®.

Además, ha habido intentos para desarrollar productos terapéuticos pequeños que no son anticuerpos, es decir, miméticos de anticuerpos, para aprovechar las ventajas de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, tales como unión de alta afinidad de dianas y baja inmunogenicidad y toxicidad, evitando a la vez algunos de los inconvenientes, tales como la necesidad de enlaces disulfuro ¡ntradominio que requieren replegamiento apropiado, y la tendencia de los fragmentos de anticuerpo a agregarse y ser menos estables que los IgG de longitud completa. Un ejemplo es un armazón de "minicuerpo", que está relacionado con el plegamiento de inmunoglobulina, que se diseña suprimiendo tres cadenas beta de un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo monoclonal (Tramontano et al, J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Esta proteína incluye 61 restos y puede usarse para presentar dos bucles hipervariables, de forma muy similar a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en anticuerpos. Estos dos bucles se han distribuido al azar y los productos se han seleccionado para la unión al antígeno, pero hasta la fecha el armazón parece tener una utilidad algo limitada debido a problemas de solubilidad. Otro armazón usado para presentar bucles ha sido tendamistat, una proteína pequeña inhibidora de a-amilasa, que contiene un sándwich de lámina beta de seis cadenas, de 74 restos, que se mantiene unido por dos enlaces disulfuro y que forma 3 bucles de tipo CDR (McConnell y Hoess, J. Mol. Biol. 25:46, 1995).

Otras proteínas se han ensayado como estructuras y se han usado para presentar restos distribuidos al azar en superficies helicoidales alfa (Nord et al., Nat Biotechnol. 15:772, 1997; Nord et al., Protein Eng. 8:61, 1995), bucles entre hélices alfa en haces de hélices alfa (Ku y Schultz, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995), y bucles restringidos por puentes disulfuro, tales como los de los inhibidores de proteasas pequeños (Markland et al., Biochemistry 35:845, 1996; Markland et al., Biochemistry 35:858, 1996; Rottgen y Collins, Gene 164:243, 1995; Wang et al., J. Biol. Chem. 27:1225, 1995).

Koide A et al.: "The fibronectin type III domain as a scaffold for novel binding proteins", Journal Of Molecular Biology, vol. 284, N° 4, 11 diciembre 1998 (1998-12-11), páginas 1141-1151 describen la preparación de una biblioteca de presentación de fagos de FN3 en la que en dos bucles de superficie se distribuyeron restos al azar. Se seleccionaron FN3 mutantes que se unían a un ligando de ensayo, la ubiquitina, con afinidades significativas; el FN3 de tipo silvestre no mostró afinidad medible.

Batori V et al.: "Exploring the potential of the monobody scaffold: effects of loop elongation on the stability of a fibronectin type III domain", Protein Engineeríng, vol. 15, N° 12, 1 de enero de 22, páginas 115-12, describen el desarrollo de miméticos de anticuerpos pequeños, 'monocuerpos', usando como armazón el décimo dominio de fibronectina de tipo III de fibronectina humana (FNfn1). Inicialmente, se realizaron alteraciones en dos bucles de FNfn1 que eran estructuralmente equivalentes a dos de los bucles hipervariables del dominio de inmunoglobulina. Para evaluar la posibilidad de utilizar otros bucles en FNfn1 para la unión con diana, se investigaron los efectos de la elongación de cada bucle en la estabilidad conformacional de FNfn1. Los resultados sugirieron que todos los bucles, excepto el bucle EF, podrían usarse para modificar técnicamente un sitio de unión.

Koide Akiko et al.: "Monobodies: antibody mimics based on the scaffold ofthe fibronectin type III domain", Methods ¡n Molecular Biology, vol. 352, 1 de enero de 27, páginas 95-19, describen el uso del décimo dominio de fibronectina de tipo III de fibronectlna humana (FNfn1) como un armazón para presentar múltiples bucles de superficie para la unión con diana.

Karatan E et al.: "Molecular Recognltlon Properties of FN3 Monobodies that Blnd the Src SH3 Domain", Chemlstry and Biology, Current Biology, vol. 11, N° 6, 1 de junio de 24, páginas 835-844, describen la construcción de una biblioteca de presentación de fagos basada en el armazón del décimo dominio de fibronectina humana de tipo III (FN3) distribuyendo al azar restos en sus bucles FG y BC. Para analizar las propiedades de reconocimiento de los agentes de unión seleccionados se realizaron experimentos de unión competitiva, de reemplazo de bucles y de perturbación por RMN.

El documento WO 25/56764 A2 describe polipéptidos de único dominio que se unen con el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular 2 (VEGFR-2).

Gilí D S et al.: "Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds", Current Opinión In Biotechnology, vol. 17, N° 6, 1 de diciembre de 26, páginas 653-658, revisaron el desarrollo de nuevas tecnologías de armazón proteico, incluyendo anticuerpos de único dominio, productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños, tetranectiñas, AdNectinas, proteínas de dominio A, lipocalinas y proteínas de repetición de ankirina.

El documento US 6 818 418 B1 (Lipovsek et al.) desvela proteínas que incluyen un dominio de fibronectina de tipo III que tiene al menos un bucle distribuido al azar.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar moléculas de tipo anticuerpo artificiales, estables, pequeñas para una diversidad de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La cita o el análisis de una referencia en el presente documento no debería interpretarse como una admisión de que esta es técnica anterior de la presente invención.

3. Sumario de la invención

La presente invención proporciona un armazón polipeptídico recombinante que comprende:

I. siete dominios de cadena beta designados A, B, C, D, E, F y G;

II. unidos a seis regiones de bucle, en las que una región de bucle conecta con cada cadena beta y se denomina bucle AB, BC, CD, DE, EF, y FG;

III. en el que al menos una región de bucle es una variante de origen no natural de la región de bucle afín en SEC ID N°: 1; y

IV. en el que dicho armazón comprende al menos un enlace disulfuro para unir cualquiera de dos de dichos siete dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta correspondientes al tercer dominio de fibronectina III de tenascina C, Tn3 (SEC ID N°: 65), o Tn3 (SEC ID N°: 66); o en el que dicho armazón comprende al menos dos enlaces disulfuro para unir cualquiera de dos dichos siete dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta correspondientes a Tn3SS3+4 (SEC ID N°: 67).

Preferentemente, un armazón de la invención se une con una diana.

Preferentemente, en un armazón de la invención, dicho bucle BC comprende:

9 aminoácidos que tienen una secuencia de S-X-a-X-b-X-X-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa prolina o alanina y en la que (b) representa alanina o glicina; u

11 aminoácidos que tienen una secuencia de S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, en la que X representa cualquier aminoácido y en la que (c) representa prolina, serina o glicina;... [Seguir leyendo]

1. Un armazón polipeptídico recombinante que comprende:

I. siete dominios de cadena beta designados A, B, C, D, E, F y G;

II. unidos a seis regiones de bucle, en las que una región de bucle conecta cada cadena beta y se designa bucle AB, BC, CD, DE, EFy FG;

III. en el que al menos una región de bucle varía por deleción, sustitución o adición de al menos un aminoácido de las regiones de bucle de SEC ID N°: 1; y

IV. en el que dicho armazón comprende al menos un enlace disulfuro para unir dos cualesquiera de dichos sietes dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta del tercer dominio de Fibronectina III de tenascina C, Tn3SS3 (SEC ID N°: 65), o Tn3SS4 (SEC ID N°: 66); o en el que dicho armazón comprende al menos dos enlaces disulfuro para unir dos cualesquiera de dichos siete dominios de cadena beta, en el que dicho armazón comprende las secuencias de cadena beta de Tn3SS3+4 (SEC ID N°: 67).

2. El armazón de la reivindicación 1, en el que el armazón se une con una diana.

3. El armazón de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho bucle BC comprende:

a. 9 aminoácidos que tienen una secuencia de S-X-a-X-b-X-X-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa prolina o alanina y en la que (b) representa alanina o glicina; o

b. 11 aminoácidos que tienen una secuencia de S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G, en la que X representa cualquier aminoácido y en la que (c) representa prolina, serina o glicina; o

c. 12 aminoácidos que tienen una secuencia de A-d-P-X-X-X-e-f-X-l-X-G, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (d) representa prolina, glutamato o lisina, en la que (e) representa asparagina o glicina, y en la que (f) representa serina o glicina.

4. El armazón de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho bucle FG comprende:

a. 9 aminoácidos que tienen una secuencia de X-a-X-X-G-X-X-X-S, en la que X representa cualquier aminoácido, y en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina; o

b. 1 aminoácidos que tienen una secuencia de X-a-X-X-X-X-b-N-P-A, en la que X representa cualquier aminoácido, en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina y en la que (b) representa serina o glicina; o

c. 11 aminoácidos que tienen una secuencia de X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A, en la que X representa cualquier aminoácido y en la que (a) representa asparagina, treonina o lisina.

5. El armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha diana es un antígeno de superficie celular, un antígeno soluble, un antígeno inmovilizado, un antígeno inmunosilencioso, un antígeno intracelular, un antígeno intranuclear, un autoantígeno, un antígeno no propio, un antígeno de cáncer, un antígeno bacteriano o un antígeno viral.

6. El armazón de cualquier reivindicación precedente, en el que dicho armazón se conjuga con un agente heterólogo, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: otro armazón, polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano (HSA), una región Fe de un anticuerpo, una molécula IgG, un péptido de unión, fármaco citotóxico, radiomarcador, agente de captura de imágenes, etiqueta de His, biotina, etiqueta Flag, ácido nucleico y una citocina.

7. Una armazón multimérico que comprende al menos armazones de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos armazones están unidos con otro armazón, una molécula IgG o fragmento de la misma, una región Fe, un dominio de dimerización, un entrecruzamiento químico, un enlace disulfuro o un enlazador de aminoácidos.

8. Una biblioteca de presentación de polipéptidos que comprende un armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que al menos una región de bucle está distribuida al azar con respecto a longitud y/o diversidad.

9. La biblioteca de presentación de polipéptidos de la reivindicación 8, en la que dicho armazón se presenta en la superficie de un ribosoma, bacteriófago, virus, bacteria o levadura.

1. Un método para obtener un armazón polipeptídico que se une con una diana, comprendiendo dicho método (a) poner en contacto un ligando diana con la biblioteca de la reivindicación 8 o 9 en condiciones que permiten que se forme un complejo de armazómligando diana, y (b) obtener del complejo, el armazón que se une con el ligando diana.

11. El método de la reivindicación 1, que comprende además distribuir al azar al menos un bucle de dicho armazón de la proteína obtenida de la etapa (b) para generar un armazón distribuido al azar adicionalmente y repetir las etapas (a) y (b) usando dicho armazón distribuido al azar adicionalmente.

12. Una composición estéril, sin pirógenos, que comprende un armazón de la reivindicación 1 y un vehículo o

excipiente farmacéuticamente aceptable.