Anticuerpos que se unen al dominio extracelular del receptor Tirosina cinasa ALK.

Un anticuerpo scFv que se une a la proteína cinasa de linfoma anaplásico (ALK) humana,

comprendiendo dicho anticuerpo scFv

(i) una secuencia de la cadena pesada variable de SEC ID N.°: 4, y

(ii) una secuencia de la cadena ligera variable de SEC ID N.°: 5,

uniéndose dicho anticuerpo a un epítopo peptídico de ALK de 16 aminoácidos de SEC ID N.°: 1 con una afinidad Kd de 10 nM o menor y en donde el anticuerpo no se une a la proteína ALK de ratón.

Anticuerpos que se unen al dominio extracelular del receptor Tirosina cinasa ALK Campo de la técnica

En la presente memoria se divulga un anticuerpo específico para ALK humana (cinasa de linfoma anaplásico), en particular un scFv, una secuencia de ácido nucleico que lo codifica, su producción y su uso como sustancia farmacéutica o para fines diagnósticos. Dicho anticuerpo es adecuado para el tratamiento local de tumores o cáncer, en particular glioblastoma.

Técnica anterior

ALK (cinasa de linfoma anaplásico; CD246) es un miembro de la familia de receptores tirosina cinasa (RTK). Como miembro típico de esta familia, es una proteína transmembrana de tipo I que esencialmente consiste en tres dominios: el dominio extracelular de unión a ligando (aa 19-1038), que contiene un dominio de clase A del receptor de LDL y dos dominios MAM (MAM: meprlna, antígeno A5, proteína tirosina fosfatasa p), un dominio transmembrana (aa 1039-1059) y un dominio citoplásmico (aa 1060-1620), que contiene el dominio tirosina cinasa. En el extremo N terminal de la proteína naciente (aa 1-18) está presente un péptido de señal que se escinde tras la secreción.

En 1997, dos grupos independientes (Iwahara 1997; Morris 1997) clonaron ALK de longitud completa humana y de ratón. ALK es muy similar a la RTK denominada tirosina cinasa de leucocitos (LTK) y pertenece a la superfamilia de receptores de insulina. ALK exhibe un 57% de identidad de aa y un 71% de similitud de aa con LTK en sus regiones de solapamiento (Morris 2001). ALK está altamente N-glicosilada y contiene 21 sitios posibles de N-glicosilación. Los aminoácidos 687 a 1034 tienen una similitud significativa (identidad de aa del 50%) con LTK. No obstante, la secuencia de 686 aa proximal al extremo N terminal no muestra homología con ninguna proteína conocida, con la excepción de una secuencia muy corta que también se encuentra en el receptor de LDL (Duyster 2001/SWISSPROT). Además, contiene dos dominios MAM en los aa264-427 y los aa478-636 (meprina, antígeno A5, proteína tirosina fosfatasa p). Se piensa que estos dominios tienen una función de adherencia, ya que están extendidos entre diversas proteínas de adherencia implicadas en la interacción entre células (De Juan 2002). Además, existe un sitio de unión para los posibles ligandos de ALK correspondiente a los aminoácidos 396-406 (Stoica 2001; véase más adelante). La secuencia de aminoácidos del dominio cinasa de ALK murina muestra una identidad de aa del 98% con ALK humana, una identidad del 78% con LTK de ratón, del 52% con ros de ratón, del 47% con el receptor del factor de crecimiento insulínico humano y del 46% con el receptor de insulina humano (Iwahara 1997; Ladanyi 2000). Hasta la fecha no se han descrito variantes de corte y empalme de ALK. No obstante, ALK se asocia a menudo con translocaciones cromosómicas (véase más adelante).

El gen de ALK abarca aproximadamente 315 kb y tiene 26 exones. Gran parte del gen consiste en dos intrones grandes que abarcan aproximadamente 170 kb. El transcrito de ALK tiene una longitud de 6,5 kb (Kutok 2002). De acuerdo con Morris, el ADNc abarca 6.226 pb (Morris 2001).

La expresión de ALK en ratones comienza durante la embriogénesis aproximadamente en la etapa de desarrollo E11 y persiste en los periodos de desarrollo neonatales, en los que se expresa en el sistema nervioso. En adultos, su expresión fisiológica está restringida a determinadas regiones neuronales (células neurales y gliales y, probablemente, células endoteliales) del SNC a niveles bajos (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001). En realidad, la abundancia de ALK disminuye en el periodo posnatal (Morris 2001). Basándose en su patrón de expresión, se sugiere un papel para el receptor en el desarrollo del cerebro (Duyster 2001). La expresión restringida neural de ALK sugiere que sirve como receptor de factores neurotróficos (véase más adelante). De manera coherente con esto, su patrón de expresión se solapa con los genes que codifican la familia de TRK de receptores de neurotrofina (Morris 2001). No obstante, los ratones knockout para ALK no muestran ningún fenotipo obvio (datos no publicados), lo que podría deberse a alguna redundancia funcional con los miembros de la familia de TRK u otros receptores de neurotrofina. Notablemente, los tejidos hematopoyéticos no muestran expresión detectable de ALK (véase más adelante) (Morris, 2001).

Recientemente se han descrito dos ligandos potenciales para ALK, "pleiotrofina" (PTN) y "midkina" (MK) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica 2002). La interacción PTN-ALK se identificó usando la proteína pleiotrofina humana purificada para seleccionar una biblioteca de péptidos de presentación en fagos. Mediante este método se identificó una secuencia de ALK presente en su dominio extracelular (aa 396-406). De manera importante, esta secuencia no se comparte con LTK, la RT más estrechamente relacionada con ALK. Esta región de unión a ligando también está conservada en el homólogo de ALK potencial en Drosophila (Loren 2001). ALK se fosforila rápidamente tras la unión a PTN (Bowden 2002). Además, se ha demostrado que ALK está estimulada por pleiotrofina en cultivos celulares. Esto hace que la interacción pleiotrofina/ALK sea particularmente interesante a la luz de las implicaciones patológicas que tiene la pleiotrofina (Stoica 2001). Las líneas celulares que carecen de expresión de ALK tampoco muestran una respuesta de crecimiento a la pleiotrofina y vice versa (Stoica, 2001). In vivo, se han demostrado niveles elevados de pleiotrofina en el suero de pacientes que padecen diversos tumores sólidos y en estudios animales se ha sugerido una contribución de la pleiotrofina al crecimiento tumoral (Stoica, 2001). El papel del PTN

como factor angiogénico limitante de la velocidad en el crecimiento tumoral está bien establecido en modelos animales (Choudhuri 1997). En 1996, Czubayko et al. (Czubayko 1996) demostraron la importancia de PTN en la angiogénesis tumoral, en la prevención de la apoptosls y en la metástasis modulando los niveles de PTN con un abordaje dirigido a las rlbozlmas. La determinación de los niveles en suero de PTN en ratones demostró una clara correlación con el tamaño del tumor. PTN desempeña un papel importante en algunos de los tipos de cáncer humano más agresivos, tales como el melanoma y el cáncer de páncreas, lo que aporta perspectivas interesantes para posibles aplicaciones futuras de un inhibidor de ALK (Weber 2000; Stoica 2001). En pacientes humanos, se han encontrado niveles de plelotroflna en suero elevados en pacientes con cáncer de páncreas (n = 41; P<0,0001) y cáncer de colon (n = 65; P = 0,0079). En individuos sanos, la PTN se expresa de un modo estrechamente regulado durante el desarrollo perlnatal de órganos y en poblaciones selectivas de neuronas y de glía en el adulto.

La coexpresión de PTN y ALK, tal como se encuentra en varias líneas celulares de cáncer, indica que podrían formar un bucle autocrlno de estimulación del crecimiento (Stoica, 2001). A pesar de todos estos datos, la bibliografía indica que todavía no está claro si los efectos de PTN están mediados por ALK sola y/o por otros receptores de PTN no Identificados (Duyster 2001). Se han sugerido al menos otros dos posibles receptores de PTN: la tirosina fosfatasa receptora RPTPp y el hepar ánsulfato proteogllcano N-sindecan. No obstante, RPTPp podr ía actuar como modüiador de la señalización de PTN/ALK y N-sindecan como chaperona para el ligando (Bowden 2002).

Recientemente se ha identificado otro factor de crecimiento secretado relacionado con la pleiotrofina denominado midkina (MK) como segundo ligando para ALK. De forma parecida a PTN, las funciones de unión y activación (por ejemplo, la inducción de la formación de colonias en agar blando en cultivos celulares) de MK se pueden bloquear mediante el mismo anticuerpo producido contra ECD de ALK (Stoica 2001). Al igual que la pleiotrofina, la midkina está regulada positivamente en muchos tumores, aunque su expresión fisiológica está muy restringida en los tejidos normales adultos (Stoica, 2002). El análisis de 47 muestras de tumor de vejiga urinaria reveló que la expresión de MK está significativamente potenciada (aproximadamente cuatro veces) en comparación con el tejido de vejiga urinaria normal. Adicionalmente, la sobreexpresión pronunciada se correlaciona con una mala supervivencia de los pacientes (OBrien 1996).

No obstante, la afinidad de MK por ALK es aproximadamente 5 veces menor que la de la pleiotrofina (Stoica 2002). De manera interesante, al Igual que con la pleiotrofina, la Inhibición de ALK mediante ribozimas Inhibe también los efectos de MK en cultivo celular (Stoica 2002). Los autores de estos estudios también han llegado a la conclusión... [Seguir leyendo]

Un anticuerpo scFv que se une a la proteína cinasa de linfoma anaplásico (ALK) humana, comprendiendo dicho anticuerpo scFv

(i) una secuencia de la cadena pesada variable de SEC ID N.°: 4, y

(ii) una secuencia de la cadena ligera variable de SEC ID N.°: 5,

uniéndose dicho anticuerpo a un epltopo peptídico de ALK de 16 aminoácidos de SEC ID N.°: 1 con una afinidad Kd de 10 nM o menor y en donde el anticuerpo no se une a la proteína ALK de ratón.

El anticuerpo scFv de la reivindicación 1, comprendiendo dicho anticuerpo la estructura NFI2-VL-enlazador- VH-COOFI o NFI2-VH-enlazador-VL-COOH, en donde el enlazador tiene la secuencia SEC ID N.°: 16.

El anticuerpo scFv de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, estando dicho anticuerpo radiomarcado o marcado con una toxina.

El anticuerpo scFv de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso como un medicamento o como una herramienta diagnóstica.

El uso del anticuerpo scFv de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la producción de un medicamento para el tratamiento de cánceres o tumores.

El uso según la reivindicación 5, en donde el medicamento es adecuado para la inhibición de la unión de MK y/o PTN a ALK y/o la señalización mediada por ALK.

El uso de la reivindicación 5 o 6, en donde el medicamento es adecuado para administrar dicho anticuerpo scFv junto con un agente anticanceroso, por ejemplo, metotrexato.

El uso de la reivindicación 5, en donde el tratamiento es un tratamiento de neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de mama, melanoma, cáncer de páncreas, LNFI de linfocitos B, carcinoma de tiroides, carcinoma microcítico de pulmón, retinoblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer de páncreas, lipoma, liposarcoma, fibrosacoma, en particular glioblastoma, neuroblastoma y rabdomiosarcoma.

Una secuencia de ADN que codifica el anticuerpo scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

Un vector de expresión que comprende la secuencia de ADN de la reivindicación 9.

Una célula hospedadora adecuada transformada con el vector de expresión de la reivindicación 10, en particular una célula E. coli.

Un método para la producción de un anticuerpo scFv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 11 en condiciones que permiten la síntesis de dicho anticuerpo scFv y recuperarlo de dicho cultivo.