Anticuerpos monoclonales inmunomoduladores humanizados para el tratamiento de enfermedad neoplásica o inmunodeficiencia.

Un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de anticuerpo monoclonal murino BAT-1 (mBAT-1) y una región estructural (FR) derivada de una inmunoglobulina humana aceptora,

en el que el anticuerpo humanizado conserva la actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal mBAT-1 y es menos inmunogénico en un sujeto humano que dicho anticuerpo murino.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la inmunoterapia, y más específicamente se refiere a anticuerpos monoclonales humanizados útiles para la terapia de una variedad de indicaciones, particularmente en el tratamiento de cáncer.

Antecedentes de la invención El cáncer en sus diferentes formas es una causa importante de muerte en los seres humanos. Los tratamientos terapéuticos más ampliamente usados del cáncer son cirugía, radiación y quimioterapia. El rápido aumento de conocimiento en los últimos años sobre las bases moleculares y celulares de la regulación inmunitaria, particularmente al nivel de respuestas de linfocitos T, proporciona un nuevo arsenal de enfoques inmunoterapéuticos que incluyen el desarrollo de vacunas tumorales. Se mostró que ciertos anticuerpos monoclonales (mAb) tenían actividad inmunomoduladora que incluye la capacidad de unir determinantes sobre la superficie de linfocitos T e inducir la proliferación, activación o diferenciación de estas células.

Los anticuerpos monoclonales derivados de hibridomas de ratón contienen considerables extensiones de secuencias de aminoácidos que son inmunogénicas cuando se inyectan en un paciente humano, frecuentemente eliminando la eficacia terapéutica del anticuerpo después de un tratamiento inicial. Aunque la producción de los denominados “anticuerpos quiméricos” (es decir, regiones variables de ratón unidas a regiones constantes humanas) ha demostrado ser algo satisfactoria, sigue existiendo un significativo impedimento de inmunogenicidad.

Se ha utilizado la tecnología de ADN recombinante para producir inmunoglobulinas que contienen regiones estructurales (FR) humanas combinadas con regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un ratón donante o inmunoglobulina de rata. Estas nuevas proteínas se denominan inmunoglobulinas “remodeladas” o “humanizadas” y el proceso por el que la inmunoglobulina donante se convierte en una inmunoglobulina tipo humano combinando sus CDR con una región estructural humana se denomina “humanización”. Los anticuerpos humanizados son importantes debido a que se unen al mismo antígeno que los anticuerpos originales, pero son menos inmunogénicos cuando se inyectan en seres humanos.

La patente de EE.UU. nº 6.294.654 desvela una molécula de inmunoglobulina modificada o fragmento funcional o parte de la misma (Ig) , que tiene un péptido antigénico extraño para la Ig incorporada en uno o más bucles no CDR, y en la que se mantiene el principal contorno de la región estructural del dominio constante. Adicionalmente se desvela el uso del anticuerpo modificado para uso terapéutico o profiláctico.

La patente de EE.UU. nº 6.074.635 desvela un método para la activación independiente de antígeno de linfocitos T in vitro que comprende poner en contacto linfocitos T en ausencia de antígeno con una combinación de al menos dos citocinas seleccionadas del grupo que consiste en interleucina-2, interleucina-6 y factor de necrosis tumoral alfa,

o fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos.

La patente de EE.UU. nº 5.658.741 desvela un método de inducción de la activación y proliferación de linfocitos T, comprendiendo dicho método: (a) conjugar una pluralidad de anticuerpos monoclonales específicos de linfocitos T con una molécula de aminodextrano que tiene 7-20 % en peso de grupos amina y un peso molecular de al menos 100.000 daltons, en los que la relación molar de dichos anticuerpos con dicho aminodextrano es mayor o igual a dos; y (b) hacer reaccionar dicho conjugado con una muestra que contiene dichos linfocitos T para efectuar la unión de dichos anticuerpos conjugados con dichos linfocitos T para inducir la activación y proliferación de dichos linfocitos T.

La patente de EE.UU. 5.585.089 de Queen et al. desvela una inmunoglobulina humanizada que tiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina donante y regiones estructurales de la región variable de la cadena pesada y ligera de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina aceptora humana, inmunoglobulina humanizada que se une específicamente a un antígeno con una constante de afinidad de al menos M-1

107 y no superior a aproximadamente cuatro veces la de la inmunoglobulina donante, en la que dicha inmunoglobulina humanizada comprende aminoácidos de la región estructural de inmunoglobulina donante fuera de las CDR de Kabat y Chothia, en la que los aminoácidos donantes sustituyen a aminoácidos correspondientes en las regiones estructurales de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina aceptora, y cada uno de dichos aminoácidos donantes: (I) es adyacente a una CDR en la secuencia de inmunoglobulina donante, o (II) contiene un átomo dentro de una distancia de 4Å de una CDR en dicha inmunoglobulina humanizada.

La patente de EE.UU. 5.225.539, de Winter, desvela un anticuerpo alterado o fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que un dominio variable del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno tiene las regiones

estructurales de un primer dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina y las regiones determinantes de la complementariedad de un segundo dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina, en el que dicho segundo dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina es diferente de dicho primer dominio variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina en especificidad de unión por antígeno, afinidad de unión al antígeno, especies, clase o subclase.

El documento US 5.225.539 y la patente de EE.UU. 5.585.089 no proporcionan herramientas suficientes y descripción completa para llevar a cabo la síntesis de un anticuerpo alterado, particularmente un anticuerpo humanizado, por un experto en la materia.

La patente de EE.UU. nº 5.897.862 de uno de los inventores de la presente invención, que se incorpora en el presente documento por referencia, desvela un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en el que el anticuerpo monoclonal: (i) es secretado por la línea celular de hibridoma depositada en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) , con el nº de acceso I-1397, o (ii) reconoce el mismo epítope antigénico que el anticuerpo bajo (i) . El anticuerpo monoclonal desvelado en el documento US5.897.862 está dirigido contra células “Daudi”, una línea celular linfoblastoide B humana, y se mostró que estimulaba linfocitos murinos y linfocitos T de sangre periférica humana (Hardy et al, Cell Immunol. 118:22, 1989) . Este anticuerpo murino también se denomina mBAT-1 en lo sucesivo. El anticuerpo mBAT-1 también presenta efectos antitumorales e inmunoestimulantes en diversos tipos de tumores (Hardy et al., Int. J. Oncol. 19:897, 2001) que incluyen tumores de origen humano (Hardy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5756, 1997) .

La solicitud de patente internacional WO 00/58363 de uno de los inventores de la presente invención desvela un anticuerpo monoclonal que tiene una región variable que comprende la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera kappa de mBAT-1 o una región variable de la cadena pesada y/o una región variable de la cadena ligera kappa que tiene al menos el 70 % de identidad con la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera kappa de mBAT-1.

En ningún sitio en la técnica anterior se enseña o sugiere que un anticuerpo monoclonal humanizado que comprende CDR de un origen murino y FR de un origen humano pueda provocar una respuesta inmunitaria y pueda adicionalmente presentar actividad anticancerígena. Además, hay una necesidad sin cumplir de métodos fiables para diseñar anticuerpos humanizados funcionales, ya que es muy conocido en la técnica que la síntesis del anticuerpo humanizado de la presente invención no puede basarse predecible o rutinariamente en la técnica anterior.

Sumario de la invención Es un objetivo de la presente invención proporcionar un anticuerpo inmunomodulador monoclonal humanizado, también denominado en lo sucesivo hBAT-1, que se una a células linfoblastoides B e induzca la proliferación y activación de linfocitos de la sangre periférica. Dicho hBAT-1 se basa en el anticuerpo inmunomodulador monoclonal murino previamente conocido, también denominado en el presente documento mBAT-1, que se une a células linfoblastoides B e induce la proliferación y activación de linfocitos de la sangre periférica y adicionalmente provoca un efecto antitumoral cuando se inyecta en un sujeto que tiene un tumor.

La presente divulgación proporciona una descripción completa del proceso de humanización de... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de anticuerpo monoclonal murino BAT-1 (mBAT-1) y una región estructural (FR) derivada de una inmunoglobulina humana aceptora, en el que el anticuerpo humanizado conserva la actividad antitumoral del anticuerpo monoclonal mBAT-1 y es menos inmunogénico en un sujeto humano que dicho anticuerpo murino.

2. El anticuerpo monoclonal humanizado de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo humanizado induce un mayor efecto antitumoral que el inducido por el anticuerpo BAT-1 murino parental.

3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal murino BAT-1 (mBAT-1) , en el que dicho anticuerpo humanizado comprende:

a. las regiones variables de la cadena ligera de fórmula: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 en la que cada FR es independientemente una región estructural de un anticuerpo humano, y cada CDR es una región determinante de la complementariedad, derivada de BAT-1;

b. las regiones variables de la cadena pesada de fórmula: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 en la que cada FR es por separado una región estructural de un anticuerpo humano, y cada CDR es una región determinante de la complementariedad, de mBAT-1.

4. Un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene una región Fab genéticamente modificada que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal murino BAT-1 (mBAT-1) , en el que el anticuerpo genéticamente modificado conserva la actividad biológica de dicho mBAT-1 y en el que dicho anticuerpo genéticamente modificado monoclonal comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

(i) una región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de: CDRH1 (SEC ID Nº: 12) ; CDRH2 (SEC ID Nº: 13) ; CDRH3 (SEC ID Nº: 14) ; y una región variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de CDRL1 (SEC ID Nº: 9) ; CDRL2 (SEC ID Nº: 10) ; CDRL3 (SEC ID Nº: 11) ;

(ii) regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos que tienen más de aproximadamente el 80 por ciento de similitud con todas o parte de las secuencias de: CDRH1 (SEC ID Nº: 12) ; CDRH2 (SEC ID Nº: 13) ; CDRH3 (SEC ID Nº: 14) ; CDRL1 (SEC ID Nº: 9) ; CDRL2 (SEC ID Nº: 10) ; CDRL3 (SEC ID Nº: 11) ;

(iii) un anticuerpo de (i) o (ii) en el que uno o más residuos de aminoácidos se han añadido, delecionado, sustituido o modificado químicamente sin afectar sustancialmente la actividad biológica o especificidad de unión del anticuerpo.

5. El anticuerpo monoclonal humanizado de la reivindicación 4, en el que las regiones estructurales (FR) derivan de un anticuerpo humano.

6. El anticuerpo monoclonal humanizado de la reivindicación 3 que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal murino BAT-1 (mBAT-1) , en el que dicho anticuerpo humanizado comprende:

a. regiones variables de la cadena ligera de fórmula: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4 en la que cada FR es independientemente una región estructural de un anticuerpo humano, y cada CDR es una región determinante de la complementariedad, en el que la secuencia de aminoácidos de CDRL1 es SARSSVSYMH (SEC ID Nº: 9) ; CDRL2 es RTSNLAS (SEC ID Nº: 10) ; CDRL3 es QQRSSFPLT (SEC ID Nº: 11) ;

b. las regiones variables de la cadena pesada de fórmula: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 en la que cada FR es por separado una región estructural de un anticuerpo humano, y cada CDR es una región determinante de la complementariedad, en el que la secuencia de aminoácidos de: CDRH1 es NYGMN (SEC ID Nº: 12) ; CDRH2 es WINTDSGESTYAEEFKG (SEC ID Nº: 13) ; CDRH3 es VGYDALDY (SEC ID Nº: 14) .

7. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo humanizado induce un mayor efecto antitumoral que el anticuerpo monoclonal BAT-1 murino; o en el que dicho anticuerpo humanizado induce un mayor efecto antimetastásico que el anticuerpo monoclonal BAT-1 murino; o en el que las FR de la región variable de la cadena pesada derivan de las FR de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo hsighv1295 humano; o en el que las FR de la región variable de la cadena ligera kappa se basan en las FR de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo TEL9 humano; o que tiene una región constante kappa humana; o en el que el anticuerpo está adicionalmente marcado con una marca detectable, inmovilizado sobre una fase sólida, o conjugado con un compuesto heterólogo; o

en el que dichas regiones variables de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humanizado están seleccionadas del grupo que consiste en: BATRκA (SEC ID Nº: 15) , BATRκB (SEC ID Nº: 16) , BATRκC (SEC ID Nº: 17) , BATRκD (SEC ID Nº: 18) , y las regiones variables de la cadena pesada están seleccionados del grupo que consiste en: BATRHA (SEC ID Nº: 20) , BATRHB (SEC ID Nº: 21) , BATRHC (SEC ID Nº: 22) , BATRHD (SEC ID Nº: 23) o BATRHE (SEC ID Nº: 24) ; o en el que dichas regiones variables del anticuerpo monoclonal humanizado están seleccionadas del grupo que consiste en: BATRHA/BATRκA (SEC ID Nº: 20/SEC ID Nº: 15) , BATRHB/ BATRκA (SEC ID Nº: 21/SEC ID Nº: 15) , BATRHB/ BATRκB (SEC ID Nº: 21/SEC ID Nº: 16) , BATRHC/ BATRκB (SEC ID Nº: 22/SEC ID Nº: 16) , BATRHB/ BATRκD (SEC ID Nº: 21/SEC ID Nº: 18) o BATRHC/ BATRκD (SEC ID Nº: 22/SEC ID Nº: 18) .

8. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 6, en el que dicha región variable de la cadena ligera es BATRκD (SEC ID Nº: 18) , y en el que dicha región variable de la cadena pesada es BATRHC (SEC ID Nº: 22) .

9. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

10. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es de isotipo IgG; preferentemente en el que dicha subclase de isotipo está seleccionada de IgG1 o IgG4.

11. Un fragmento de anticuerpo derivado del anticuerpo humanizado de la reivindicación 6, en el que el fragmento de anticuerpo está seleccionado del grupo que consiste en: Fv, F (ab') , F (ab') 2, un anticuerpo monocatenario.

12. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 6 generado por tecnología de ADN recombinante, utilizando injerto de CDR.

13. Una construcción de polinucleótido aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones 1-12 o fragmentos de los mismos.

14. La construcción de polinucleótido aislado según la reivindicación 13 que codifica una región variable de la cadena ligera kappa seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 18; preferentemente en la que la construcción de polinucleótido aislado está seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 87, SEC ID Nº: 88, SEC ID Nº: 89.

15. La construcción de polinucleótido aislado según la reivindicación 13 que codifica una región variable de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 20, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 24; preferentemente en el que la construcción de polinucleótido aislado está seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID Nº: 90, SEC ID Nº: 91, SEC ID Nº: 92.

16. Un vector que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la reivindicación 13 a 15.

17. El vector de la reivindicación 16, que comprende además al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica un componente seleccionado del grupo que consiste en: un promotor operativamente ligado al polinucleótido que codifica el anticuerpo, uno o más genes de resistencia, una secuencia de Kozak, un origen de replicación, uno o más genes marcadores de selección, un elemento potenciador, terminador de la transcripción, un péptido señal, región constante kappa humana genómica, región constante IgG humana genómica.

18. El vector de la reivindicación 17, en el que el vector es un plásmido o un virus; preferentemente en el que el vector está seleccionado del grupo que comprende: pKN110, pG1D200, pG1KD210, pUC o pBR322.

19. El vector de la reivindicación 16, que comprende la secuencia de polinucleótidos de SEC ID Nº: 93.

20. Una célula huésped que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 16-19.

21. La célula huésped de la reivindicación 20, capaz de expresar un anticuerpo o fragmentos del mismo; o en el que la célula está seleccionada de eucariotas y procariotas; o seleccionada del grupo que consiste en: células CHO, CHOdhfr, NSO, COS o COS7.

22. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-12; preferentemente que comprende además un vehículo, diluyente o estabilizador fisiológicamente aceptable.

23. Uso de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer; preferentemente en el que el cáncer está seleccionado de melanoma, tumores de pulmón, cáncer colorrectal o metástasis hepáticas.

24. Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones

1. 12 para la preparación de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho anticuerpo o fragmentos de anticuerpos para inducir actividad proliferativa, citolítica o estimulante de linfocitos T CD4+.

25. Uso de un anticuerpo monoclonal humanizado o fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la preparación de una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de dicho anticuerpo o fragmentos de anticuerpos para aumentar la supervivencia de linfocitos T CD4+ activados.

26. Uso según la reivindicación 24 o 25, en el que la composición farmacéutica se refiere al tratamiento de una deficiencia genética o inmunoadquirida; o en el que la composición farmacéutica se refiere al tratamiento de las fases tempranas de la infección por el VIH; o en el que la composición farmacéutica se refiere al tratamiento de SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) ; o en el que la composición farmacéutica se refiere al tratamiento de pacientes que tienen un hemograma que muestra una disminución en linfocitos T CD4+.

27. Un método para producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende:

(i) transfectar una célula huésped con un vector que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica dicho anticuerpo, o co-transfectar la célula huésped con 2 vectores que comprende cada uno una secuencia de polinucleótidos que codifica las regiones de la cadena pesada o ligera de dicho anticuerpo;

(ii) cultivar la célula huésped de (i) de manera que se exprese dicho anticuerpo; y

(iii) recuperar el anticuerpo del huésped.