Anticuerpos de MASP-2.

Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconocen específicamente y se unen a un fragmento de polipéptido de MASP-2 humana que consiste en los dominios de CCP1,

CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1), donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de desplazar uno o más anticuerpos de referencia en un ensayo ELISA competitivo, donde el uno o más anticuerpos de referencia se seleccionan del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito 03050904;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2657;

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2660;

iv. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2658; y

v. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2659,

donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de inhibir la deposición de C4.

Anticuerpos de MASP-2 Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos de MASP-2 y a equivalentes funcionales de los mismos. En particular, la invención se refiere a anticuerpos de MASP-2 capaces de inhibir la función de MASP-2. Además, la invención se refiere a métodos para producir dichos anticuerpos, a métodos para inhibir la actividad de MASP-2, así como a las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos de MASP-2.

Antecedentes de la invención

El sistema de complemento comprende un conjunto complejo de enzimas y proteínas no enzimáticas de importancia para la función del sistema inmunitario tanto innato como adaptativo1. Hasta hace poco se conocían dos modos de activación, el mecanismo clásico iniciado por complejos anticuerpo-antígeno y el mecanismo alternativo iniciado por determinadas estructuras sobre superficies microbianas. Se ha descrito un tercer mecanismo nuevo e independiente de anticuerpos para la activación complementaria2 Dicho mecanismo se inicia cuando una lectina de unión a manano (MBL, del inglés "mannan-binding lectin", descrita primero como una "proteína" de unión a manano3, MBP, véase Ezekowitz, Patente de EE.UU. n° 5.27.199) se une a carbohidratos y se conoce como el mecanismos MBLectin.

La MBL está relacionada estructuralmente con el subcomponente C1q del componente C1 del complemento, y parece que la MBL activa el sistema de complemento a través una serina proteasa asociada denominada MASP4 ó p15, que es similar a los componentes C1 r y C1 s del mecanismo clásico. El nuevo mecanismo de activación de complemento se denomina mecanismo MBLectin. De acuerdo al mecanismo postulado para esta ruta, la MBL se une a estructuras de carbohidrato específicas que se encuentran en la superficie de un rango de microorganismos que incluyen bacterias, levaduras, protozoos parasitarios y virus5, y su actividad antimicrobiana procede de la activación de los componentes del mecanismo de complemento líticos terminales7 o de promover fagocitosis8.

Las MASPs (serina proteasas asociadas a MBL) son serina proteasas similares en estructura al C1 r y el C1 s del mecanismo de complemento. La MASP-1 tiene una estructura de lazo de histidina del tipo observado en la tripsina y en las serina proteasas similares a la tripsina. Se ha observado que la MASP-1 está implicada en la activación de complemento por MBL. Se ha publicado que un clon de ADNc que codifica MASP-1 que codifica un péptido líder putativo de 19 aminoácidos seguidos de 68 residuos de aminoácido predichos para formar el péptido maduro.

La MASP-2 (serina proteasa 2 asociada a MBL)22 es una serina proteasa también similar en estructura al C1 r y al C1 s del mecanismo de complemento. Como éstos, y al contrario que la MASP1, no presenta estructura de lazo de histidina del tipo observado en la tripsina y en las serina proteasas de tipo tripsina. Se ha observado que la MASP-2 está implicada en la activación de complemento por MBL.

Los anticuerpos de MASP-2 han sido descritos previamente en la técnica.

El documento WO 2/646 describe la MASP-2 humana. El documento describe además anticuerpos de MASP-2 generados inmunizando conejos con los 19 aminoácidos N-terminales de la MASP-2 humana o pollos con los aminoácidos 55 a 523 y los aminoácidos 538 a 556 de la MASP-2 humana.

Petersen et al., 1998, Molecular Immunology, vol. 35, n° 6/7, pág. 49, describe la generación de anticuerpos de MASP-2 usando sistemas de expresión bacterianos. Los anticuerpos reaccionan con MASP-2 en un ensayo TRIFMA y/o Western blot.

Sumario de la invención

De forma interesante, los inventores de la presente invención han reconocido que la inhibición del mecanismo MBLectin puede ser deseable para el tratamiento de una serie de afecciones clínicas. Sin embargo, los inhibidores específicos del mecanismo MBLectin no están bien caracterizados en la técnica y por tanto existe una necesidad no cubierta de inhibidores específicos.

La presente invención describe que los anticuerpos de la parte C-terminal de MASP-2 son capaces de inhibir la actividad de MASP-2 más eficazmente que los anticuerpos de la parte N-terminal de MASP-2. La invención además describe epítopos de MASP-2, donde los anticuerpos que reconocen dichos epítopos son particularmente útiles para inhibir la actividad de MASP-2. Los epítopos preferidos se describen en la presente memoria.

En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o a un fragmento de unión a antígeno del mismo que reconoce específicamente y se une a un epítopo de la parte C-terminal de la MASP-2 humana, donde la parte C- terminal de la MASP-2 humana consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo reconoce específicamente al menos parte de un epítopo reconocido por uno o más anticuerpos de referencia seleccionados del grupo que consiste en:

donde el anticuerpo es capaz de inhibir la deposición de C4.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos o equivalentes funcionales de los mismos que reconocen específicamente y se unen a un epitopo de la parte C-terminal de MASP-2 o a un homólogo funcional del mismo.

Además se describe proporcionar polipéptidos aislados que comprenden un fragmento C-terminal de MASP-2, siendo útil dicho polipéptido para activar anticuerpos de epítopos del extremo C de la MASP-2. En particular, los polipéptidos aislados de la parte C-terminal de la MASP-2 o un homólogo funcional del mismo, pueden ser polipéptidos que comprenden o que consisten en:

I. los dominios de EGF, CUB2, CCP1, CCP2 y serlna proteasa; o ¡I. los dominios de CUB2, CCP1, CCP2 y serlna proteasa; o

iii. el dominio de CCP1; o

iv. el dominio de CCP2; o

el dominio de CCP1 y el de CCP2.

También se describe proporcionar métodos para producir un anticuerpo que inhiba la actividad de MASP-2, inmunizando un animal, preferiblemente un mamífero, con polipéptidos aislados que comprenden un fragmento C- terminal de la MASP-2, siendo útil dicho polipéptido para activar anticuerpos de epítopos del extremo C de la MASP-

2. En particular, los polipéptidos aislados de la parte C-terminal de la MASP-2 o de un homólogo funcional de la misma, pueden ser polipéptidos que comprenden o que consiste en:

v. los dominios de EFG, CUB2, CCP1, CCP2 y serina proteasa; o

vi. los dominios de CUB2, CCP1, CCP2 y serina proteasa; o

vii. el dominio de CCP1 y el dominio de serina proteasa; o

viii. el dominio de CCP2 y el dominio de serina proteasa; o

ix. los dominios de CCP1, CCP2 y de serina proteasa

x. el dominio de serina proteasa

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para producir un... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que reconocen específicamente y se unen a un fragmento de polipéptido de MASP-2 humana que consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1), donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno del mismo, son capaces de desplazar uno o más anticuerpos de referencia en un ensayo ELISA competitivo, donde el uno o más anticuerpos de referencia se seleccionan del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito 3594;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2657;

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC266;

iv. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2658; y

v. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2659,

donde el anticuerpo, o el fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de inhibir la deposición de C4.

2. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de desplazar uno o más anticuerpos de referencia seleccionados del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito 3594;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2657; y

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC266.

3. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número

3594;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número DSM ACC2657;

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número DSM ACC266;

iv. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número DSM ACC2658; y

v. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número DSM ACC2659;

o un fragmento de unión a antígeno de los mismos.

4. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho fragmento de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en los fragmentos Fab, Fab, F(ab)2 y Fv.

5. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla.

6. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde el polipéptido fragmento de MASP-2 humana consta de los dominios de CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 363 a 686 de la SEQ ID 1).

7. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde el polipéptido fragmento de MASP-2 humana consta del dominio de serina proteasa (aminoácidos 445 a 686 de la SEQ ID 1).

8. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de inhibir la deposición de C4 en suero completo.

9. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende o que consiste en la SEQ ID 4.

de depósito de depósito de depósito de depósito de depósito

1. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden una región variable de la cadena ligera que comprende o que consiste en la SEQ ID 5.

11. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende o que consiste en la SEQ ID 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende o que consiste en la SEQ ID 5.

12. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, comprende la CDR3 de la cadena pesada de la SEQ ID 8, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, son capaces de inhibir la deposición de C4.

13. Un método para seleccionar un anticuerpo que reconozca específicamente y que se una a un fragmento de polipéptido de la MASP-2 humana que consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1), donde dicho anticuerpo es capaz de inhibir la deposición de C4, comprendiendo dicho método las etapas de administrar a un mamífero un fragmento de polipéptido de MASP-2 humana que consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1) o un homólogo funcional que sea idéntico en al menos un 98% a los aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1, evaluar si los anticuerpos son capaces de inhibir la deposición de C4 y seleccionar los anticuerpos capaces de inhibir la deposición de C4.

14. El método según la reivindicación 13, donde dicho fragmento de polipéptido de MASP-2 humana consiste en los dominios de CCP2 y serina proteasa.

15. El método según la reivindicación 13, donde dicho fragmento de polipéptido de MASP-2 humana consiste en el dominio de serina proteasa.

16. El método según la reivindicación 13, donde el método comprende además el aislamiento de células productoras del anticuerpo a partir de dicho mamífero, la preparación de células de hibridoma a partir de dichas células productoras de anticuerpo, el cultivo de dichos hibridomas y el aislamiento de los anticuerpos producidos por dichos hibridomas.

17. Un método para seleccionar un anticuerpo que reconozca específicamente y que se una a un fragmento de polipéptido de la MASP-2 humana que consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1), comprendiendo dicho método las etapas de administrara un mamífero un fragmento de polipéptido de MASP-2 que consiste en los dominios de CCP1, CCP2 y serina proteasa de MASP-2 (aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1) o un homólogo funcional del mismo que sea idéntico en al menos un 98% a los aminoácidos 293 a 686 de la SEQ ID 1, identificar y seleccionar los anticuerpos que reconozcan dicho polipéptido, y determinar si dichos anticuerpos son capaces de desplazar a uno o más anticuerpos de referencia en un ensayo ELISA competitivo, donde el anticuerpo de referencia se selecciona del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito 3594;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2657;

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC266;

iv. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2658; y

v. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2659.

18. El método según la reivindicación 17, donde los anticuerpos de referencia se seleccionan del grupo que consiste en:

i. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito 3594;

ii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC2657; y

iii. el anticuerpo monoclonal producido por la línea celular de hibridoma depositada bajo el número de depósito DSM ACC266.

19. El método según la reivindicación 17 ó 18, donde el método además comprende seleccionar anticuerpos capaces de desplazar al menos uno de dichos anticuerpos de referencia.

2. El método según la reivindicación 17 ó 18, donde la etapa de determinación de si dichos anticuerpos son capaces de desplazar uno o más anticuerpos de referencia en un ensayo ELISA competitivo comprende llevar a cabo las etapas de:

i. Proporcionar MASP-2 o un fragmento de la misma que comprenda el epítopo reconocido por dicho anticuerpo de referencia; y

ii. Añadir un anticuerpo de ensayo y dicho anticuerpo de referencia a dicha MASP-2, donde el anticuerpo de ensayo o el anticuerpo de referencia están marcados con una etiqueta detectable, o ambos anticuerpos están marcados con diferentes etiquetas detectables; y

iii. Detectar la presencia de la etiqueta detectable en la MASP-2;

iv. Detectar de este modo si el anticuerpo de ensayo es capaz de desplazar al anticuerpo de referencia.

21. El método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 2, donde el método comprende además la evaluación de los anticuerpos para determinar si dicho anticuerpo es capaz de inhibir la deposición de C4, y seleccionar anticuerpos capaces de inhibir la deposición de C4.

22. Un método para inhibir la deposición de C2 y/o C4 catalizada por MASP-2 que comprende las etapas de:

i. Proporcionar una composición que comprenda MASP-2;

ii. Proporcionar un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15;

iii. Incubar dicha composición con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antigeno de la misma, inhibiendo de este modo la deposición de C2 y/o C4 catalizada por MASP-2,

con la condición de que el método no lleve a cabo in vivo.

23. El método según la reivindicación 22, donde la composición es suero.

24. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

25. Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en el tratamiento de una afección clínica en un individuo que lo necesite.

26. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 25, donde la afección clínica es isquemia/lesión por reperfusión.

27. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 26, donde la lesión es resultado de PTCA (angioplastia coronaria transluminal percutánea) o CABG (injerto de bypass de arteria coronaria).

28. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 26, donde dicha lesión es resultado de infarto agudo de miocardio o isquemia cerebral.

29. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 25, donde la afección clínica se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide y lupus sistémico eritematoso.

3. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 25, donde la afección clínica es una enfermedad inflamatoria crónica.

31. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 25, donde la afección clínica es una afección inflamatoria autoinmune.