Procedimiento de análisis de glóbulos blancos.

Un procedimiento para enumerar los recuentos absolutos de linfocitos en una muestra de sangre,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

combinar dicha muestra con un primer compuesto de unión marcado con un colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD45RA en una mezcla, en el que

dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con el mismo colorante fluorescente;

medir las señales de fluorescencia de dichos compuestos de unión marcados con colorante fluorescente que se han unido a células en dicha muestra; y

en ausencia de una medición de la dispersión lateral, enumerar los linfocitos en dicha muestra.

Procedimiento de análisis de glóbulos blancos Antecedentes Los marcadores de superficie celular permiten la identificación de fenotipos característicos de estados tanto sanos como de enfermedad, por ejemplo Maecker y col., J. Clin. Immunol., 20: 391 -399 (2000) ; Rothe y col., Leukemia,

10: 877 -895 (1996) ; Reilly y col., J. Clin. Pathol., 54: 508 -511 (2001) . Dichos marcadores normalmente se miden mediante tinción de una muestra celular con una selección de anticuerpos marcados específicos de diferentes marcadores, seguido de análisis multiparamétricos mediante obtención de imágenes o mediante citometría de flujo, por ejemplo Stewart, Immunophenotyping (Wiley-Liss, 2000) . Adicionalmente, J. Wang-Rodriguez y col., Transfusion 40 (1) :25 -34 (2000) describen procedimientos para evaluar la modulación inmunitaria tras transfusiones de sangre alogénicas en lactantes. Las muestras de sangre se analizaron para determinar las subpoblaciones de linfocitos usando citometría de flujo tras tinción de fluorescencia doble. El documento WO2006/056061 describe procedimientos usando ligandos específicos de los linfocitos T no expuestos previamente, marcadores CD3, CD4, CD45RA, junto con ligandos específicos de CD31 para identificar, clasificar y purificar linfocitos T no expuestos previamente. Cada uno de estos ligandos se marca con un colorante fluorescente distinto, en particular CD3 se marcan con PECy7 y CD45RA se marcan con PECy5. En el documento EP-A-317156 se describe la detección e identificación de diferentes linajes y estadios del desarrollo celular en una muestra de células hematopoyéticas usando dos tipos de anticuerpos monoclonales que están conjugados con diferentes fluorocromos que tienen distintos espectros de emisión. D.L. Morris y col., J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 37 (1) :37 -46 (1997) describen inmunotipado de subpoblaciones de linfocitos de rata con los anticuerpos fluorescentes. P. Mikolajczak y col., Drug and Alcohol Dependence 60 (3) : 303 -309 (2000) describen la medición del número absoluto y relativo de linfocitos en subpoblaciones específicas (CD3, CD4, CD8, NK, CD45RA) mediante citometría de flujo. J. Nicholson y col., Cytometr y 26:227 -230 (1996) divulgan el uso de anticuerpos CD45/CD3/CD4 marcados de forma diferente para inmunofenotipado citométrico, que requiere una medición de la dispersión lateral. De un modo similar, Berrington, J.

E. y col., Chem. Exp. Immunol. 140 (2) :289 -292 divulgan la determinación de subpoblaciones de linfocitos usando anticuerpos marcados de forma diferente. Por ultimo, a partir de K. Morikara y col., Scand. J. Imumol. 34 (3) : 273 283 (1991) se sabe que CD45RA se expresa en casi todos los linfocitos B. Los análisis multiparamétricos con anticuerpos marcados, o inmunofenotipado, han sido particularmente útiles para identificar distintas clases funcionales y de desarrollo de glóbulos blancos, lo que tiene importantes aplicaciones en la clasificación de enfermedades relacionadas con la sangre, tales como leucemias y linfomas, y en el control del estado de individuos afectados por VIH. En la última aplicación, es particularmente deseable medir el número absoluto por unidad de volumen de sangre de linfocitos T colaboradores, así como el número relativo de dichas células entre los linfocitos totales. Estas mediciones mediante inmunofenotipado suponen un reto porque los marcadores de superficie celular característicos de estas células son compartidos en grados variables por los glóbulos blancos que no son linfocitos. En consecuencia, la mayoría de los abordajes actuales para la identificación de poblaciones de linfocitos requiere la medición de al menos una propiedad celular, como la dispersión de luz frontal o lateral cuando se usa un sistema de flujo, además de mediciones basadas en los marcadores de superficie celular. Sería altamente ventajoso, en particular para aplicaciones en los puntos de cuidados de bajo coste, si se dispusiera de procedimientos y composiciones para analizar glóbulos blancos, en particular linfocitos, y sus respectivas subpoblaciones en base a los marcadores de superficie celular.

Sumario de la invención La invención proporciona procedimientos y composiciones para analizar glóbulos blancos. En el primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para enumerar los recuentos absolutos de linfocitos en una muestra de sangre, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

combinar dicha muestra con un primer compuesto de unión marcado con un colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con un colorante fluorescente específico de CD45RA en una mezcla, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con el mismo colorante fluorescente;

medir las señales de fluorescencia a partir de dichos compuestos de unión marcados con colorante fluorescente que se han unido a células en dicha muestra; y en ausencia de una medición de la dispersión lateral, enumerando los linfocitos en dicha muestra. Los linfocitos en la muestra de sangre, combinados con dichos compuestos marcados forman una subpoblación distinguible en base a la cantidad de compuestos marcados que se unen específicamente a sus superficies, de modo que se permite la detección y enumeración de dichos linfocitos.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para determinar el porcentaje de linfocitos T colaboradores en una muestra de sangre, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

combinar dicha muestra con un primer compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante

fluorescente específico de CD45RA en una mezcla, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con un primer colorante fluorescente, y un tercer compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD4, en el que dicho tercer compuesto de unión está marcado con un colorante fluorescente que es distinto de dicho primer colorante fluorescente;

medir las señales de fluorescencia a partir de dichos compuestos de unión marcados con colorante fluorescente que se han unido a células en dicha muestra; enumerar los linfocitos en dicha muestra;

en ausencia de una medición de dispersión lateral, enumerar los linfocitos T colaboradores en dicha muestra y determinar el porcentaje de linfocitos T colaboradores en dicha muestra.

En un tercer aspecto, la invención proporciona el uso de un kit que comprende un primer compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de un marcador específico e linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD45RA, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con el mismo colorante fluorescente, para enumerar los recuentos absolutos de linfocitos en una muestra de sangre de acuerdo con el procedimiento del primer aspecto anterior o para determinar el porcentaje de linfocitos T colaboradores en una muestra de sangre de acuerdo con el procedimiento del primer aspecto anterior. La invención proporciona un procedimiento conveniente y eficaz para identificar linfocitos, para recuentos absolutos o en porcentaje de las mediciones de los glóbulos blancos, en una muestra de sangre únicamente en base a los marcadores de superficie, sin la necesidad de mediciones basadas en la dispersión de luz para distinguir los linfocitos de otros tipos de glóbulos blancos, tales como monocitos o granulocitos. La invención es particularmente adecuada para usar con dispositivos de identificación celular basada en imágenes para proporcionar mediciones del porcentaje de las poblaciones CD4+ en muestras de sangre entera.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1A muestra un gráfico de dispersión de las intensidades del dispersador de luz lateral y las intensidades de fluorescencia de los glóbulos blancos marcados siendo un primer y un segundo compuesto de unión dos anticuerpos, uno con especificidad para CD45RA y una especificidad para CD3. Ambos anticuerpos están marcados con ficoeritrina (PE) y las mediciones se realizaron con un citómetro de flujo.

La Fig. 1B muestra un histograma de los recuentos frente a la intensidad de señal solo para los linfocitos de la Fig. 1A, en el que los picos de los histogramas solapantes corresponden a las líneas de identificación que conectan los picos con sus respectivos números de identificación 100, 102 y 104.

La Fig. 1C contiene una tabulación de los datos de recuentos correspondientes a los gráficos de las Figs.... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para enumerar los recuentos absolutos de linfocitos en una muestra de sangre, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

combinar dicha muestra con un primer compuesto de unión marcado con un colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD45RA en una mezcla, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con el mismo colorante fluorescente;

medir las señales de fluorescencia de dichos compuestos de unión marcados con colorante fluorescente que se han unido a células en dicha muestra; y en ausencia de una medición de la dispersión lateral, enumerar los linfocitos en dicha muestra.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos primer y segundo compuestos de unión son anticuerpos.

3. Un procedimiento para determinar el porcentaje de linfocitos T colaboradores en una muestra de sangre, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

combinar dicha muestra con un primer compuesto de unión marcado con un colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD45RA en una mezcla, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con un primer colorante fluorescente y dicho tercer compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD4, en el que dicho tercer compuesto de unión está marcado con un colorante fluorescente que es distinto de dicho primer colorante fluorescente;

medir las señales de fluorescencia a partir de dichos compuestos de unión marcados con colorante fluorescente que se han unido a células en dicha muestra; enumerar los linfocitos en dicha muestra;

en ausencia de una medición de la dispersión lateral, enumerar los linfocitos T colaboradores en dicha muestra; y determinar el porcentaje de linfocitos T colaboradores en dicha muestra.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dichos primer, segundo y tercer compuestos de unión son anticuerpos.

5. Uso de un kit que comprende un primer compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de un marcador específico de linfocitos T que es CD2 o CD3 y un segundo compuesto de unión marcado con colorante fluorescente específico de CD45RA, en el que dicho primer compuesto de unión y dicho segundo compuesto de unión están marcados con el mismo colorante fluorescente, para enumerar los recuentos absolutos de linfocitos en una muestra de sangre de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 1.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que dichos primer y segundo compuestos de unión son anticuerpos.