Actividades antimicrobianas derivadas de fagos.

Un polipéptido quimérico que comprende

(i) un dominio muralítico (MD) que tiene una identidad de al menos un 90 % con los aminoácidos 669 - 808 de la SEC ID Nº 1;

y

(ii) un dominio de unión celular heterólogo (CDB) que se une a una bacteria diana, teniendo dicho polipéptido quimérico actividad bactericida.

Actividades antimicrobianas derivadas de fagos Campo de ¡a invención

La presente invención proporciona métodos y composiciones para reducir el crecimiento de colonias microbianas, incluyendo infecciones, e incluye composiciones terapéuticas, métodos para el tratamiento de infecciones y métodos para identificar otras composiciones de este tipo.

Antecedentes de ¡a invención

Las bacterias son ubicuas y se encuentran en casi todos los ambientes habitables. Son frecuentes y diversas ecológicamente y encuentran nichos inusuales y frecuentes para su supervivencia. Están presentes en el ambiente y están presentes en el suelo, el polvo, el agua y en prácticamente todas las superficies. Muchas son cepas normales y beneficiosas, que proporcionan una relación sinèrgica con los huéspedes. Otras no son tan beneficiosas o causan problemas además de beneficios.

Las bacterias patógenas pueden producir enfermedades infecciosas en seres humanos, en otros animales y también en plantas. Algunas bacterias solo pueden hacer enfermar a determinados huéspedes; otras causan problemas en una serie de huéspedes, depende de la especificidad por el huésped de la bacteria. Las enfermedades causadas por las bacterias son casi tan diversas como las propias bacterias e incluyen intoxicación alimentaria, caries dental, ántrax, enfermedades infecciosas generales e incluso determinadas formas de cáncer. Estas normalmente son el sujeto del campo de la microbiología clínica.

Las bacterias son destruidas en la naturaleza por virus específicos de bacterias, por ejemplo bacteriófagos, o fagos. Muchos fagos que se encuentran en la naturaleza pertenecen al grupo de los Caudovirales, o fagos "con cola". Estos virus tienen, invariablemente, un único genoma de ADN bicatenario empaquetado en una cápside proteinácea. El fago consiste en tres estructuras fundamentales: La cabeza, que, en general, tiene una simetría icosaédrica, una estructura de cola que surge a partir de un vértice de la cabeza icosaédrica y 4-6 fibras de cola unidas a alguna parte de la cola. Cabe destacar que el orden Caudovirales contiene tres morfotipos generales. Podoviridae (podofago), Myovlrldae (miofago) y Siphoviridae (sifofago). Hablando en sentido estricto, el podofago no tiene una "cola" separada morfogenétlcamente; es decir, la estructura de tipo cola realmente se monta como parte el ensamblaje de la cabeza o la cápside. En los miofagos y sifofagos, existen vías de morfogénesis separadas para las cabezas, las colas y las fibras de la cola; en última instancia, las tres se unen para formar viriones infecciosos completos. En los podofagos, existe una vía para la cabeza y una vía para las fibras de la cola. Desde una perspectiva funcional, la estructura de tipo cola de los podofagos hace la misma función que las colas genuinas de los otros dos morfotipos.

Los fagos destruyen a las células mediante Infección, replicación y, después, lisado de la célula huésped, liberando muchos viriones como progenie en el proceso. Determinados elementos derivados de fagos también pueden destruir células. Por ejemplo, muchas cepas de Pseudomonas producen piocinas, componentes proteináceos que destruyen otras cepas de Pseuc/omonas. En general, el término "bacteriocina" se usa para describir compuestos producidos por bacterias que destruyen otras bacterias; se conocen bacteriocinas de una amplia variedad de estructura química, desde moléculas pequeñas a pollpéptldos. No obstante, se ha descubierto que muchas de las piocinas son "colas sin cabeza", es decir colas de fago producidas sin cabezas o ADN. Estas bacteriocinas de tipo cola destruyen a las bacterias adsorbiéndolas y causando una lesión fatal en la cubierta celular, aunque al carecer de ADN, no existe replicación ni llsls del huésped. Desde el descubrimiento original de las piocinas en Pseuc/omonas, se han Identificado bacteriocinas de tipo cola similares en una amplia variedad de otras bacterias, incluyendo especies tanto gramposltlvas como gramnegatlvas. Véase, por ejemplo, Nakayama, et al. (2000) Mol. Microbiol. 38:213 - 31; Traub, et al. (1996) Zentralbl. Bakteñol. 284:124 - 35; Ito, et al. (1986) J. Virol. 59:103 - 111; Rocourt (1986) Zentralbl. Bakteñol. Mlkroblol. Hyg. 261:12 - 28; Shlnomlya (1984) J. Virol. 49:310 - 14; Ishii, et al. (1965) J. Mol. Biol. 13:428 - 431; Daw y Falklner (1996) Micron. 27:467 - 479; Strauch, et al. (2001) Appi. Environ. Microbiol. 67:5635 - 5642; y Abdelhamld, et al. (2002) Appi. Environ. Microbiol. 68:5704 - 5710. Además, se han descrito otros elementos bactericidas derivados de fagos. Por ejemplo, los Caudovirales codifican una endolisina como parte de las funciones de llsls de la célula huésped. Estas enzimas degradan la pared de la célula huésped, lo que conduce a la lisis y liberación de los viriones progenie. Se ha demostrado que las endolisinas del fago añadidas exógenamente a los cultivos y suspensiones de bacterias pueden Usar y destruir una señe de bacterias grampositivas. Véase, por ejemplo, Fischietti, et al. (2005), solicitud de patente de EE.UU. 20050208038, que describen el uso de endolisinas de fagos para destruir bacterias y Takac y Blas! (2005) Antlmicrob. Agents and Chemother. 49:2934 - 2940.

Otras divulgaciones que se refieren a proteínas de fagos incluyen Sheehan et al. (1996) FEMS Microbiol. Lett. 140,23 - 28; Croux et al. (1993) Mol. Microbiol. 9, 1019 - 1025; Lopez et al. (2004) Drug Disc. Today 1.469 - 474; Borysowskl et al. (Apr. 2006) Exp. Blol. Med. 231, 366 - 377; Donovan et al. (Apr. 2006) Appi. Environ. Microbiol. 72, 2988 - 2996; documento WO 2008/001342; Sanz et al. (1996) Eur. J. Biochem. 235, 601 - 605; Kwan et al. (2005) PNAS USA 102, 5174 - 5179; Unlprot database entry:Q8CNS6; Bateman et al. (2003) Trends Biochem. Sci. 28, 234

- 237. Documentos US 2005/208038, US 2002/006406, US 2005/214773, US 2002/086020, O'Flaherty (2004) J. Bact. 186, 2862 - 2871 ; y Saba et al. (1996) EMBO J. 15.4789 - 4797.

Determinadas bacterias son normalmente inocuas pero se convierten en patógenas tras la presentación de ia oportunidad adecuada o se hacen problemáticas tras la introducción en un lugar o ubicación anormal. Personas que carecen de sistemas inmunitarios eficaces son más vulnerables y determinadas bacterias usan huéspedes débiles susceptibles para proporcionar un entorno temporal para proliferar y dispersarse por la población.

Estadísticamente, las enfermedades infecciosas son un problema médico importante. Véase, por ejemplo, Watstein y Jovanovic (2003) Statistical Handbook on infectious Diseases Greenwood, ISBN: 1573563757. En EE.UU., aproximadamente 40 - 70 mil muertes anuales son el resultado de infecciones en la circulación sanguínea nosocomiales (que se producen en el hospital).

Los antibióticos han revolucionado la medicina clínica en la última mitad de siglo. Desde el descubrimiento original del fenómeno antibiótico, el mecanismo de acción y el desarrollo de esta clase de importantes entidades terapéuticas han realizado enormes progresos. Véase, por ejemplo, Therrien y Levesque (2000) FEMS Microbio! Rev. 24:251 - 62; Durgess (1999) Chest 115(3 Suppl):19S-23S; Medeiros (1997) Clin. Infect. Dis. 24(Suppl 1):S19 - 45; Jones (1996) Am. J. Med. 100(6A):3S-12S; Ford y Hait (1993) Cytotechnology 12:171 - 212; y Liu (1992) Compr Ther. 18:35 - 42. En 2002, los antibióticos han tenido unas ventas de aproximadamente 32 billones de dólares americanos en todo el mundo.

La amplia aparición de bacterias resistentes a antibióticos ha subrayado la vulnerabilidad de los tratamientos antimicrobianos actuales a la adaptación bacteriana. Véase, por ejemplo, Walsh (1992) Antibiotics: Actions, Origins, Resistance Amer. Soc. Microbiol., ISBN: 1555812546; Cunha (1992) Antibiotic Essentials Physicians Press, ISBN: 1890114413; Amyes (2003) Magic Bullets, Lost Horizons: The Rise and Fall of Antibiotics Taylor & Francis, ISBN: 0415272033; Axelsen (2001) Essentials of Antimicrobial Pharmacology: A Guide to Fundamentáis for Practice Humana Press, ISBN: 0896038424; y Mainous y Pomeroy (eds. 2001) Management of Antimicrobials ¡n Infectious Diseases: Impact of Antibiotic Resistance Humana Press, ISBN: 0896038211. No obstante, muchos antibióticos clásicos requieren una rápida replicación o crecimiento de las bacterias diana para ser eficaces.

Por tanto, métodos mejorados para disminuir el crecimiento de las bacterias diana o la supervivencia o la patogenicidad bacteriana limitante encontrarán gran utilidad. Esta utilidad puede ser aplicable a la colonización ambiental, local, tópica o particularmente /n v/'vo. La presente invención aborda estos y otros problemas importantes.

Breve resumen de ia invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de las actividades de... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido quimérico que comprende

(i) un dominio muralítico (MD) que tiene una identidad de al menos un 90 % con los aminoácidos 669 - 808 de la SEC ID Ns 1;y

(¡i) un dominio de unión celular heterólogo (CDB) que se une a una bacteria diana, teniendo dicho polipéptido quimérico actividad bactericida.

2. El polipéptido quimérico de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID N- 4 - 6 y 8.

3. El polipéptido quimérico de la reivindicación 2, en donde dicho polipéptido comprende la SEC ID N- 4.

4. Un polipéptido quimérico que comprende

(I) un dominio muralítico (MD) que tiene una Identidad de al menos un 90 % con los aminoácidos 669 - 808 de la SEC ID Ns 1;y

(¡I) un dominio heterólogo de unión a la pared celular de S. aureus, teniendo dicho polipéptido quimérico actividad de degradación de la mureína de Sfaphy/ococcus.

5. El polipéptido quimérico de las reivindicaciones 1 o 4, en el que el MD comprende una secuencia con al menos una Identidad del 90 % con los aminoácidos 629 - 808 de la SEC ID N-1.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5 para su uso en un método de tratamiento de una Infección bacteriana en un sujeto que necesita tal tratamiento.

9. Un método /n v/'fro de degradar la pared celular de una bacteria, comprendiendo el método poner en contacto la pared celular con el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5.

10. Un método no terapéutico de desinfectar una superficie, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto la superficie con el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5.

11. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que el MD comprende una secuencia con al menos una identidad del 95 % con los aminoácidos 669 - 808 de la SEC ID N-1.

12. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que el MD comprende una secuencia con al menos una identidad del 95 % con los aminoácidos 629 - 808 de la SEC ID N-1.