Vectores lentivíricos que contienen un promotor del CMH de clase I.

Un vector lentivírico que comprende una secuencia transgénica que codifica un polipéptido inmunógeno,

en el que la secuencia transgénica está bajo el control transcripcional de un promotor del CMH de clase I.

Vectores lentivíricos que contienen un promotor del CMH de clase I.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención está en el campo de la tecnología de vacunas recombinantes y se refiere a mejoras en los vectores lentivíricos que se pueden utilizar como vacunas terapéuticas y profilácticas. Los vectores que contienen promotores del CMH de clase I (CMHI) proporcionan unas características mejoradas con respecto a otros vectores.

ANTECEDENTES

Las vacunas recombinantes se han ido desarrollando junto con el avance de la tecnología del ADN recombinante, permitiendo la modificación de genomas víricos para producir virus modificados. De esta manera, ha sido posible introducir secuencias genéticas en virus no patógenos de modo que codifican proteínas inmunógenas que se van a expresar en células diana después de la infección, con el fin de desarrollar una respuesta inmune específica en su hospedador.

Tales vacunas constituyen un avance importante en la tecnología de las vacunas (Kutzler et al., Nat. Rev Genet, 9(1): 776-788, 28). En particular, en comparación con las vacunas tradicionales, tienen la ventaja de evitar los virus vivos (atenuados) y eliminar los riesgos asociados con la preparación de vacunas inactivadas.

La administración de genes utilizando retrovirus modificados (vectores retrovíricos) fue introducida a principios de los años 8 por Mann et al. (Cell, 33(1): 153-9, 1983). Los vectores retrovíricos oncogénicos utilizados mayoritariamente se basan en el virus de la leucemia murina de Moloney (VLM). Tienen un genoma simple a partir del cual se producen las poliproteínas Gag, Pol y Env y son necesarias en trans para la replicación vírica (Breckpot et al., 27, Gene Ther, 14(11 ):847-62; He et al. 27, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24). Las secuencias que se requieren en general en c/s son las repeticiones terminales largas (LTRs) y sus inmediaciones: las repeticiones invertidas (sitios IR o att) necesarias para la integración, la secuencia de empaquetamiento ip, el sitio de unión al ARN de transporte (sitio de unión al cebador, PBS) y algunas secuencias adicionales implicadas en la transcripción inversa (la repetición R dentro de las LTRs y los tractos de polipurina, PPT, necesarios para la iniciación de la cadena positiva). Para generar vectores retrovíricos con replicación defectuosa, los genes gag, pol y env se eliminan generalmente de forma completa y se reemplazan por una casete de expresión.

Los vectores retrovíricos que se obtienen a partir de genomas de lentivirus (es decir, vectores lentivíricos) han surgido como herramientas prometedoras tanto para la terapia génica como con fines de inmunoterapia, debido a que muestran diversas ventajas sobre otros sistemas víricos. En particular, los vectores lentivíricos ellos mismos no son tóxicos y, a diferencia de otros retrovirus, los lentivirus son capaces de transducir células que no se dividen, en particular células dendríticas (He et al. 27, Expert Rev vaccines, 6(6):913-24), permitiendo la presentación de antíge- nos a través de la ruta endógena.

Los lentivirus están ligados a sus hospedadores por similitudes en la composición genética, mecanismos moleculares de replicación e interacciones biológicas con sus hospedadores. Se conocen mejor como agentes de síndromes de enfermedades lentas que comienzan de forma insidiosa después de períodos prolongados de infección subclínica y progresan lentamente; por lo tanto, se les conoce como los virus "lentos" (Narayan et al., 1989, J Gen Virol, 7(7): 1617-39). Tienen la misma organización básica que todos los retrovirus, pero son más complejos debido a la presencia de genes accesorios (por ejemplo, vif, vpr, vpu, nef, tat y rev), que tienen un papel clave en la replicación del lentivirus in vivo.

Los lentivirus representan un género de virus lentos de la familia Retroviridae, que incluye los virus de la inmunodefi- ciencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), el virus de la encefalitis equina infecciosa (VEEI), el virus de la artritis encefalitis caprina (VAEC), el virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y el virus de la inmunodeficiencia felina (VIF). Los lentivirus pueden persistir indefinidamente en sus hospedadores y replicarse de forma continua con tasas variables durante el curso de la infección que dura toda la vida. La persistencia de la replicación de los virus en sus hospedadores depende de su capacidad para eludir las defensas del hospedador.

El diseño de vectores lentivíricos, recombinantes e integradores se basa en la separación de las secuencias que actúan en c/s y en trans del lentivirus. Una transducción eficaz en células que no se dividen requiere la presencia de dos secuencias que actúan en c/s en el genoma del lentivirus, el tracto central de polipurina (cPPT) y la secuencia de terminación central (CTS). Estas causan la formación de una estructura de ADN de triple cadena llamada "solapa" de ADN central, que maximiza la eficacia de la importación de genes a los núcleos de células que no se dividen, incluyendo las células dendríticas (CDs) (Zennou et al., 2, Cell, 11(2) 173-85; Arhel et al., 27, EMBO J, 26(12):325-37).

Las células dendríticas tienen una importancia primordial para la presentación de antígenos debido a que constituyen la clase principal de células presentadoras de antígeno (APCs) cuya función principal es la de presentar antígenos e iniciar una respuesta inmune.

Para generar una respuesta inmune, las proteínas antigénicas se tienen que procesar en las células en péptidos, que se presentan en la superficie celular a través de proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Las APCs circulantes presentan los complejos de péptido-CMH a linfocitos T en los ganglios linfáticos de drenaje, en donde interaccionan con receptores de linfocitos T y, junto con las señales coestimuladoras, activan los linfocitos T.

Una variedad de estudios han mostrado que la inoculación con vectores lentivíricos conduce a la presentación de antígenos en las CDs y a una fuerte activación de los linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno (LTCs; linfocitos T CD8+). Por lo tanto, en los últimos 1 años los vectores lentivíricos se han modificado genéticamente para la transferencia de genes y aplicaciones en inmunoterapia.

Se ha mejorado la seguridad de los vectores lentivíricos mediante la eliminación de la secuencia U3 de LTR, dando como resultado vectores con "autoinactivación" que están totalmente desprovistos de secuencias víricas de promotor y de potenciador presentes originalmente dentro de las LTRs.

Las partículas lentivíricas que contienen vectores lentivíricos, se pueden producir por tecnología recombinante después de una transfección temporal de células humanas HEK 293T cultivadas, a través de diferentes plásmidos de ADN:

(i) un plásmido de empaquetamiento que expresa al menos las proteínas Gag, Pol, Rev, Tat y, en algunos casos, proteínas estructurales y enzimáticas necesarias para el empaquetamiento de la estructura artificial de transferencia;

(ii) un plásmido de transferencia, que contiene una casete de expresión y factores de VIH que actúan en c/'s necesarios para el empaquetamiento, la transcripción inversa y la integración; y

(iii) un plásmido que codifica la envuelta, en la mayoría de los casos la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV.G), una proteína que permite la formación de partículas mixtas (seudotipos) que se pueden dirigir a una amplia variedad de células, especialmente las células presentadoras de antígeno (APCs) del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), incluyendo las CDs.

Este procedimiento permite obtener una producción temporal de vectores de partículas lentivíricas a través de las células transfectadas. Sin embargo, los vectores de partículas lentivíricas también se pueden producir de forma continua en las células, insertando de forma estable en el genoma celular los genes de empaquetamiento, el ADN que codifica el provirus y el gen de la envuelta. Esto permite la producción continua de vectores de partículas lentivíricas en las células sin tener la necesidad de una transfección temporal. Por supuesto, se puede utilizar una combinación de estos procedimientos, estando integrados algunos de los ADNs/plásmidos en el genoma celular y otros proporcionados por una transfección temporal.

Vectores lentivíricos que no se insertan o no integrativos se están diseñando para mitigar los riesgos de una potencial oncogénesis, ligada a eventos de mutagénesis por inserción, en particular para fines de vacunación:

En la vacunación basada en una inyección directa de vectores lentivíricos integrativos que codifican un antígeno,... [Seguir leyendo]

1. Un vector lentivírico que comprende una secuencia transgénica que codifica un polipéptido inmunógeno, en el que la secuencia transgénica está bajo el control transcripcional de un promotor del CMH de clase I.

2. El vector lentivírico según la reivindicación 1, en el que el vector induce una mayor respuesta de los LTCs in vivo contra el polipéptido inmunógeno codificado que un vector en el que la secuencia transgénica está bajo el control transcripcional de un promotor CMV.

3. El vector lentivírico según la reivindicación 1 o 2, en el que el promotor del CMH de clase I es un promotor HLA-A2, un promotor HLA-B7, un promotor HLA-Cw5, un promotor HLA-F o un promotor HLA-E.

4. El vector lentivírico según la reivindicación 1 o 2, en el que dicha secuencia promotora comprende una secuencia de polinucleótidos que comparte más del 9%, preferiblemente más del 95%, más preferiblemente más del 99% de identidad con la secuencia promotora de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

5. El vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende una LTR que está de- lecionada para el promotor y potenciador de U3, una secuencia cPPT/CTS procedente de lentivirus, una secuencia V (psi) o dos LTRs lentiví ricas.

6. El vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector lentivírico no contiene un potenciador.

7. El vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho polipéptido inmunógeno comprende uno o varios antígenos procedentes de las proteínas Gag, Pol y/o Nef del virus VIH o al menos un antígeno tumoral.

8. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Un método para producir una partícula de vector lentivírico que comprende las etapas de:

a) transfectar una célula hospedadora adecuada con el vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

b) transfectar dicha célula hospedadora con un vector plasmídlco de empaquetamiento que contiene secuencias de ADN vírico que codifican por lo menos actividades estructurales y de polimerasa de un retrovirus;

c) cultivar dicha célula hospedadora transfectada con el fin de obtener una expresión y el empaquetamiento de dicho vector lentivírico en las partículas de vector lentivírico; y

d) recoger las partículas de vector lentivírico que resultan de la expresión y el empaquetamiento de la etapa c) en dichas células hospedadoras cultivadas.

1. Una partícula de vector lentivírico que comprende el vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

11. Una partícula de vector lentivírico que comprende al menos los siguientes elementos de secuencia:

a) una secuencia de polinucleótido cPPT/CTS;

b) una LTR que está delecionada para el promotor y potenciador de U3; y

c) una secuencia transgénica bajo el control de un promotor del CMH de clase I.

12. La partícula de vector lentivírico según la reivindicación 11, en la que dicha secuencia de promotor comprende una secuencia de polinucleótidos que comparte más del 9%, preferiblemente más del 95%, más preferiblemente más del 99% de identidad con la secuencia de promotor de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5.

13. Un vector lentivírico o una partícula de vector lentivírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y 11-12, para uso como medicamento o vacuna.