Vacuna para tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave.

Péptido que tiene al menos una secuencia complementaria a una región inmunógena principal de un receptor de acetilcolina implicado en la miastenia grave,

caracterizado por que el péptido tiene al menos una secuencia SEQ. ID. NO. 1 con un triptófano en posición 8, que lleva al menos un grupo 2,4,6-trimetoxibencilo.

Vacuna para tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave.

La presente invención se refiere a un péptido que tiene al menos una secuencia complementaria a una región inmunógena principal de un receptor de acetilcolina de la miastenia grave, y más particularmente a una composición de vacuna del mismo para un tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave, particularmente en 5 animales domésticos o humanos.

La miastenia grave (MG) es un trastorno neuromuscular caracterizado por debilidad y fatigabilidad de los músculos esqueléticos. El efecto subyacente es una disminución en el número de receptores de acetilcolina disponibles (AChRs) en las uniones neuromusculares debida a un ataque autoinmune mediado por anticuerpos.

En la unión neuromuscular, la acetilcolina (ACh) se sintetiza en el terminal del nervio motor y se almacena en 10 vesículas (quanta) . Cuando un potencial de acción se desplaza hacia abajo en el nervio motor y alcanza el terminal del nervio, se libera ACh de 150 a 200 vesículas y se combina con AChRs que están densamente empaquetadas en los picos de los pliegues postsinápticos.

Cuando se combina ACh con los sitios de fijación en el AChR, los canales de los AChRs se abren, permitiendo la entrada rápida de cationes, principalmente sodio, lo que produce despolarización en la región de la placa terminal de 15 la fibra muscular. Si la despolarización es suficientemente amplia, inicia un potencial de acción que se propaga a lo largo de la fibra muscular, disparando la contracción del músculo. Este proceso es terminado rápidamente por hidrólisis de ACh por la acetilcolinesterasa (AChE) y por difusión de ACh lejos del receptor.

En la MG, el defecto fundamental es una disminución en el número de AChRs disponibles en la membrana muscular postsináptica. Adicionalmente, los pliegues postsinápticos están aplastados, o "simplificados". Estos cambios dan 20 como resultado una disminución de la eficiencia de la transmisión neuromuscular. Por tanto, aunque la ACh se libera normalmente, produce potenciales pequeños de la placa terminal que pueden fallar en lo que respecta al disparo de los potenciales de acción musculares. El fallo de la transmisión en muchas uniones neuromusculares da como resultado debilidad de la contracción muscular.

Las anormalidades neuromusculares en la MG están causadas por una respuesta autoinmune mediada por 25 anticuerpos anti-AChR específicos. Los anticuerpos anti-AChR se denominan anticuerpos patógenos y reducen el número de AChRs disponibles en las uniones neuromusculares por tres mecanismos distintos: (1) renovación acelerada de las AChRs por un mecanismo que implica reticulación y endocitosis rápida de los receptores; (2) bloqueo del sitio activo del AChR, es decir, el sitio que fija normalmente ACh; y (3) deterioro de la membrana muscular postsináptica por el anticuerpo en colaboración con el complemento. Los anticuerpos patógenos son IgG y 30 son dependientes de las células T.

Las manifestaciones clínicas de la enfermedad MG autoinmune están correlacionadas con la presencia de estos anticuerpos patógenos localizados en la unión neuromuscular.

Hasta la fecha, existe únicamente un pequeño número de terapias que son, o bien tratamiento sintomático, o inmunoterapia. 35

Estas terapias proporcionan beneficio clínico a los pacientes que puede ser de larga duración pero requiere un procedimiento clínico bastante complicado. Además, estos regímenes de tratamiento actuales siguen siendo sólo parcialmente eficaces en muchos pacientes afectados y son necesarios cambios de estilo de vida para grandes porcentajes de quienes padecen estas enfermedades.

El tratamiento ideal de las enfermedades autoinmunes podría ser la supresión selectiva de los componentes 40 patógenos de la respuesta inmune (es decir, los anticuerpos patógenos) por la anergia dirigida o ablación de clones de células autorreactivas.

La vacunación con un péptido diseñado como mimetizador del receptor de antígeno (ARM) para los antígenos principales de autoinmunidad ha demostrado eficacia clínica notable contra modelos de enfermedades autoinmunes en animales, véase la Patente US NO5.212.072. 45

Dicho tratamiento induce la anergia de clones autorreactivos específicos para estas proteínas inmunodominantes, a pesar de su origen heterólogo, así como una debilitación de las respuestas contra otros antígenos próximos. Parece ser que el uso de vacunas peptídicas cuyos contornos se complementan estrechamente con los de los antígenos principales en la autoinmunidad puede conducir a respuestas antiidiotípicas (Id) específicas de antígeno e indiferentes de la clase del receptor antigénico. 50

Estos péptidos, denominados péptidos complementarios, pueden fijar el determinante diana y se comportan en cierto sentido como mimetizadores de los receptores de antígeno (Ag) (ARM) . Por consiguiente, cuando se utilizan como vacunas los mismos provocan respuestas de anticuerpos anti-idiotípicos (Id) y anti-clonotípicos (anticuerpos) contra los sitios de combinación de antígeno en ciertos linfocitos autorreactivos.

A este fin, se estudió la miastenia grave en las ratas, en las cuales puede inducirse la miastenia grave de manera artificial. Se trata de la Miastenia Grave Autoinmune Experimental (EAMG) .

En la EAMG, las ratas inmunizadas con AChR purificada desarrollan una enfermedad similar. Basándose en la idea de que el antígeno y el anticuerpo interaccionan en términos de complementariedad hidropática, se ha buscado inducir inmunidad anti-Id hacia los anticuerpos patógenos por vacunación con un péptido complementario a la región 5 inmunógena principal (MIR) del AChR. Se ha encontrado que la región inmunógena principal del receptor AChR está constituida por los residuos 61 a 76 de la cadena α del receptor AChR. El péptido complementario se designó RhCA 67-16. Las ratas se vacunaron con el péptido complementario RhCA 67-16 que estaba conjugado a hemocianina de lapa bocallave (KLH) . Se demostró que tanto el suero como preparaciones de anticuerpos monoclonales de los animales vacunados con el péptido complementario se fijaban a los anticuerpos patógenos, y la incidencia de la 10 enfermedad en tales ratas se reducía notablemente en los animales vacunados (25%) comparados con los inmuni-zados con KLH y con controles sin tratar (90%) , mientras que el registro de gravedad clínica en los animales con enfermedad promediaba 1, 0 en los animales vacunados comparado con 3, 5 en los controles positivos. Además, la administración pasiva de anticuerpo monoclonal anti-Id a las ratas durante el curso de la inducción de la enfermedad reducía análogamente la incidencia y la gravedad de la EAMG [Araga A et al., Prevention of Experimental Auto-15 immune Myasthenia Gravis by a Monoclonal Antibody to a Complementar y Peptide for the Main lmmunogenic Region of the Acetylcholine Receptor. J lmmunol. 157, 386-392 (1996) ].

Teniendo en cuenta los resultados precedentes de la vacunación con el péptido complementario RhCA 67-16, se ha llegado a la conclusión de que el inmunógeno era estructuralmente similar al paratope de los anticuerpos patógenos, y por tanto esta vacuna puede considerarse como un mimetizador del receptor del antígeno (Ag) de las células B 20 (ARM) .

Con objeto de confirmar los resultados obtenidos con el péptido complementario RhCA 67-16, se produjo un segundo lote del péptido RhCA 67-16. El péptido del segundo lote exhibía el peso molecular teórico esperado.

El péptido del segundo lote RhCA 67-16 se ensayó de nuevo en ratas pero, lamentablemente, no se observaron los resultados satisfactorios obtenidos previamente en cuanto a la incidencia de la enfermedad. 25

Es un objeto de la invención proporcionar un péptido que tiene un comportamiento antigénico que puede ser útil en el tratamiento de la miastenia grave en mamíferos, en particular en perros mascotas y en humanos (al ser la MG anecdótica en los gatos) .

A este fin, la invención proporciona un péptido caracterizado por que el péptido tiene al menos una secuencia SEQ. ID. NO1 con un triptófano en posición 8 que lleva al menos un grupo 2, 4, 6-trimetoxibencilo. 30

Ventajosamente, la secuencia del péptido es complementaria a los residuos 61-76 de la cadena α del AChR. El péptido que tiene al menos una secuencia complementaria a la región inmunógena principal (MIR) del receptor AChR es el péptido RhCA 67-16. Este péptido comprende un triptófano en posición 8. Hasta la fecha, no se comprendía bien por qué, pero se ha encontrado sorprendentemente que el grupo 2, 4, 6-trimetoxibencilo tiene una importancia crucial para la fijación del péptido al... [Seguir leyendo]

1. Péptido que tiene al menos una secuencia complementaria a una región inmunógena principal de un receptor de acetilcolina implicado en la miastenia grave, caracterizado por que el péptido tiene al menos una secuencia SEQ. ID. NO. 1 con un triptófano en posición 8, que lleva al menos un grupo 2, 4, 6-trimetoxibencilo.

2. Péptido conforme a la reivindicación 1, en donde la secuencia SEQ. ID. NO. 1 es complementaria a los 5 residuos 61 a 76 de una cadena α de dicha región inmunógena humana principal del receptor de acetilcolina.

3. Composición terapéutica que comprende el péptido conforme a la reivindicación 1 y al menos un portador.

4. Composición terapéutica que comprende el péptido conforme a la reivindicación 1 y péptido que tiene al menos una secuencia SEQ ID NO. 2, secuencia que es complementaria a un sitio de reconocimiento por las células T del receptor de acetilcolina, así como al menos un portador. 10

5. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 4, en donde la secuencia SEQ ID NO. 2 es complementaria a los residuos 100 a 116 de una cadena α de dicho sitio de reconocimiento por las células T del receptor de acetilcolina.

6. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 4 que comprende una primera y una segunda formulación, comprendiendo la primera formulación dicho péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1 15 con al menos un portador, y comprendiendo la segunda formulación dicho péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 2 con al menos un portador 7. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 3 que comprende desde 750 a 25 microgramos de dicho péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante. 20

8. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 3 que comprende desde 100 a 50 microgramos de dicho péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante.

9. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 4 que comprende desde 750 a 25 microgramos de cada péptido en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante. 25

10. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 4 que comprende desde 100 a 50 microgramos de cada péptido en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante.

11. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 6 en donde la primera formulación comprende desde 750 a 25 microgramos del péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante, y la segunda formulación comprende desde 750 a 25 30 microgramos del péptido que tiene la secuencia SEQ ID NO. 2 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante.

12. Composición terapéutica conforme a la reivindicación 6, en donde la primera formulación comprende desde 100 a 50 microgramos del péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante y comprendiendo la segunda formulación desde 100 a 50 35 microgramos del péptido que tiene la secuencia SEQ ID NO. 2 en 0, 5 ml de solución salina tamponada de fosfato con al menos un adyuvante.

13. Uso de la composición conforme a la reivindicación 3 para fabricación de una vacuna para ser utilizada en un tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave en los mamíferos.

14. Uso de la composición conforme a la reivindicación 4 para fabricación de una vacuna para ser utilizada en un 40 tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave en los mamíferos.

15. Uso de la composición conforme a la reivindicación 6 para fabricación de una vacuna para ser utilizada en un tratamiento terapéutico o profiláctico de la miastenia grave en los mamíferos, debiendo administrarse dichas formulaciones primera y segunda simultánea o secuencialmente.

16. Kit de detección que comprende el péptido conforme a la reivindicación 1 para detección de anticuerpos anti-45 idiotípicos de la región inmunógena principal de la miastenia grave.

17. Método para fabricación del péptido conforme a la reivindicación 1, que comprende los pasos de:

- síntesis del péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 1, e

- hidrocarbonación de un residuo triptófano localizado en posición 8, en dicha secuencia SEQ ID NO. 1, por adición de al menos un grupo 2, 4, 6-trimetoxibencilo a dicho triptófano. 50

18. Método para fabricación de un medicamento para aplicación en la miastenia grave, que comprende los pasos de:

- síntesis del péptido conforme a la reivindicación 1, y

- acoplamiento del péptido con al menos un portador.

19. Método para fabricación de un medicamento para aplicación en la miastenia grave, que comprende los pasos 5 de:

- síntesis del péptido conforme a la reivindicación 1, - síntesis del péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 2, y - mezcladura de ambos péptidos con al menos un portador.

20. Método para fabricación de un medicamento para aplicación en la miastenia grave, que comprende los pasos 10 de:

- fabricación de la primera formulación por síntesis del péptido conforme a la reivindicación 1, y por acoplamiento del mismo con al menos un portador, y - fabricación de la segunda formulación por síntesis del péptido que tiene al menos la secuencia SEQ ID NO. 2, y por acoplamiento del mismo con al menos un portador. 15