Un método para detectar una sustancia química.

Un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

proporcionar un transductor que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz detransducir un cambio de energía en una señal eléctrica, un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor,teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al analito o un derivado del analito,exponer la muestra al transductor permitiendo de este modo que el analito o un derivado del analito se unan alprimer reactivo para formar un complejo primer reactivo-analito;

introducir un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirseselectivamente al complejo primer reactivo-analito, donde el segundo reactivo tiene un marcador unido al mismoque es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por la fuente de radiación para generarenergía por medio de desintegración no radiativa, donde el marcador está seleccionado entre una partícula decarbono, una partícula de polímero coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una moléculafluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartículaque tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y suscombinaciones;

irradiar la muestra con radiación electromagnética;

transducir la energía generada para dar lugar a una señal eléctrica; y

detectar la señal eléctrica.

Un método para detectar una sustancia química

Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para detectar una sustancia química, y en particular a un inmunoensayo que emplea un dispositivo de detección de una sustancia química que contiene un transductor piezo/piroeléctrico.

Un inmunoensayo es un ensayo que mide la presencia, o más normalmente la concentración, de un analito en un fluido biológico. Normalmente, implica la unión específica de un antígeno a un anticuerpo. El anticuerpo puede ser anticuerpos policlonales o monoclonales, que tienen varios beneficios, incluyendo reproducibilidad de fabricación y contención de la unión de un epítopo de un analito. Con el fin de proporcionar una medición cuantificable de la concentración de analito, se compara la respuesta con muestras convencionales de concentración conocida. Se puede determinar la concentración del anticuerpo por medio de una variedad de métodos, aunque uno de los más comunes es marcar bien el antígeno o bien el anticuerpo y detectar la presencia del marcador.

Los inmunoensayos pueden ser competitivos o no competitivos. En un inmunoensayo competitivo, el antígeno de la muestra desconocida compite con el antígeno marcado para unirse a los anticuerpos, que normalmente se inmovilizan sobre una fase sólida. Posteriormente, se mide la cantidad de antígeno marcado unido al sitio del anticuerpo, normalmente por medio de separación y medición del antígeno marcado unido a la fase sólida. Claramente, la respuesta será inversamente proporcional a la concentración del antígeno en la muestra desconocida. En un principio de ensayo análogo, el anticuerpo marcado en disolución compite con un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida y que está presente en la muestra, aportando una proporcionalidad inversa similar. En un inmunoensayo no competitivo, también denominado como ensayo inmunométrico, el antígeno de la muestra desconocida se une a un exceso de anticuerpos inmovilizados (los anticuerpos de "captura") y se mide la cantidad de antígeno unido. A diferencia del método competitivo los resultados del método no competitivo son directamente proporcionales a la concentración del antígeno. En el denominado ensayo inmunométrico de "dos sitios", también denominado "ensayo sándwich", el antígeno se une al sitio del anticuerpo de captura, y posteriormente se introduce el anticuerpo marcado que se une al antígeno unido al anticuerpo de captura. A continuación, se mide la cantidad de anticuerpo marcado en el sitio.

En un inmunoensayo de sándwich típico, se une un anticuerpo específico para un antígeno de interés a un soporte polimérico tal como una lámina de poliéstireno. Se deposita una gota de la muestra objeto de ensayo, por ejemplo un extracto celular o una muestra de suero u orina, sobre la lámina, que se lava tras la formación del complejo anticuerpo-antígeno. A continuación, se añade el anticuerpo específico para un sitio diferente sobre el antígeno, y se lava de nuevo el soporte. Este segundo anticuerpo porta un marcador (el indicador marcado) de manera que se puede detectar con elevada sensibilidad. La cantidad del segundo anticuerpo unido a la lámina es proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Este ensayo y otras variaciones de este tipo de ensayo se conocen bien, véase, por ejemplo, "The Immunoassay Handbook, 2ª ed." David Wild, Ed., Nature Publishing Group, 2001.

Los inmunoensayos de este tipo funcionan particularmente bien para analitos de masa molecular grande, principalmente porque se pueden abordar dos o más epítopos; las áreas de complementariedad entre analito y

anticuerpo son relativamente grandes y tienen lugar diferencias relativamente grandes entre los analitos, por ejemplo, en al menos un amino ácido de los péptidos. Con los inmunoensayos de moléculas pequeñas, la ausencia de dos epítopos prohibe la formación de un "sándwich". Esto proporciona motivación para el desarrollo de técnicas adicionales.

Una técnica de inmunoensayo relativamente nueva es el denominado inmunoesnayo de "anticuerpo anti-complejo" que está diseñada para mejorar la especificidad y la sensibilidad de detección de una molécula pequeña (véase C.H. Self y col., Clin. Chem. 1994, 40, 2035-2041; ibid 1994, 40, 2035-2041; y L.A. Winger y col, J. Inmunol. Methods 1996, 199, 185-191) . Este inmunoensayo también tiene la ventaja de que proporciona una relación directa entre la concentración de analito y la señal, en lugar de la relación inversa que comúnmente se aprecia en los 55 inmunoensayos competitivos.

El protocolo se basa en la capacidad para aumentar los anticuerpos secundarios con respecto al complejo formado cuando el analito de molécula pequeña se une a un anticuerpo primario generado de forma específica que se inmoviliza (se une a) sobre un soporte. Por medio de la selección cuidadosa del segundo anticuerpo, se puede escoger la reactividad frente a un epítopo formado en la unión del anticuerpo primario y el antígeno. Por tanto, la unión al complejo es selectiva ya que el indicador marcado no se puede unir al anticuerpo de captura "no ocupado" o al analito libre ya que no se genera el epitopo hasta que tiene lugar el primer episodio de unión. Se ha comprobado que esto es muy sensible y específico pero, como actualmente se pone en práctica, requiere un número de etapas de lavado, del modo más importante para eliminar el exceso de marcador no unido antes de la determinación de la 65 cantidad de analito marcado presente. Esto se suma significativamente a la complejidad del ensayo y limita sustancialmente la aplicabilidad de la técnica.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

proporcionar un transductor que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transducir un cambio de energía en una señal eléctrica, un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al analito o un derivado del analito, exponer la muestra al transductor, de manera que se permita que el analito o un derivado del analito se una al primer reactivo para formar un complejo primer reactivo-analito; introducir un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse selectivamente al complejo primer reactivo-analito, donde el segundo reactivo tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber radiación electromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa, donde se escoge el marcador a partir de una partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al

menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones; irradiar la muestra con radiación electromagnética; transducir la energía generada en una señal eléctrica; y detectar la señal eléctrica.

De este modo, el segundo reactivo marcado (el indicador) puede únicamente unirse al complejo del primer reactivo (reactivo de captura immovilizado) y al analito. No tiene lugar la unión del indicador a la superficie del transductor en ausencia del analito, como el inmunoensayo inmunométrico de dos sitios convencional. No obstante, en este caso el indicador únicamente requiere un epítopo individual (generado a partir del complejo analito-primer reactivo) en lugar de los dos requeridos para el ensayo de sándwich convencional, lo que facilita de este modo la detección de una molécula pequeña. Como resultado del uso de un transductor que tiene una película piezo/piroeléctrica, se logra el beneficio de ser capaz de detectar la unión del segundo reactivo (marcado) en tiempo real sin etapas de separación y lavado.

La presente invención también proporciona un estuche que comprende: (i) un dispositivo para detectar un analito en una muestra que comprende un transductor que tiene une elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transducir un cambio de energía en una señal eléctrica, un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al analito o un derivado del analito, una fuente de radiación electromagnética, y un detector para detectar la señal eléctrica; y (ii) un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse selectivamente a un complejo formado entre el primer reactivo y el analito o el derivado del analito, donde el segundo reactivo tiene un marcador... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

proporcionar un transductor que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transducir un cambio de energía en una señal eléctrica, un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al analito o un derivado del analito, exponer la muestra al transductor permitiendo de este modo que el analito o un derivado del analito se unan al primer reactivo para formar un complejo primer reactivo-analito; introducir un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse selectivamente al complejo primer reactivo-analito, donde el segundo reactivo tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber la radiación electromagnética generada por la fuente de radiación para generar energía por medio de desintegración no radiativa, donde el marcador está seleccionado entre una partícula de carbono, una partícula de polímero coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones; irradiar la muestra con radiación electromagnética; transducir la energía generada para dar lugar a una señal eléctrica; y detectar la señal eléctrica.

2. Un método como se reivindica en la reivindicación 1, donde el primer y segundo reactivos son anticuerpos.

3. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde el primer reactivo se adsorbe sobre el 25 transductor.

4. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde la el transductor está ubicado en una cámara de muestra.

5. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde la muestra contiene partículas suspendidas.

6. Un método como se reivindica en la reivindicación 6, donde la muestra es sangre.

7. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde la fuente de radiación se adapta para generar una serie de pulsos de radiación electromagnética y el detector se adapta para determinar el retardo temporal entre cada pulso de radiación electromagnética procedente de la fuente de radiación y la generación de la señal eléctrica.

8. Un método como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde el método se lleva a cabo sin retirar la muestra del transductor entre las etapas de exposición de la muestra al transductor e irradiación de la muestra .

9. Un estuche que comprende: (i) un dispositivo para detectar un analito en una muestra que comprende un transductor que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transducir un cambio

de energía en una señal eléctrica, un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al analito o un derivado del analito, una fuente de radiación electromagnética y un detector para detectar una señal eléctrica; y (ii) un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse selectivamente a un complejo formado entre el primer reactivo y el analito o el derivado del analito, donde el segundo reactivo tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber radiación electromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa, donde el marcador está seleccionado entre una partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones.

10. Un estuche como se reivindica en la reivindicación 9, donde el primer y segundo reactivos son anticuerpos.

11. Un estuche como se reivindica en las reivindicaciones 9 o 10, donde el primer reactivo se adsorbe sobre el transductor.

12. Un estuche como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el dispositivo además comprende una cámara de muestra y el transductor está ubicado en la cámara de muestra.

13. Un estuche como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde la fuente de radiación se

adapta para generar una serie de pulsos de radiación electromagnética y el detector se adapta para determinar el retardo temporal entre cada pulso de radiación electromagnética procedente de la fuente de radiación y la generación de la señal eléctrica.