Procedimiento para detectar una sustancia química.

Un procedimiento para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un transductor que comprende un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que escapaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica, y un primer reactivo inmovilizado sobre eltransductor, en el que el primer reactivo tiene un sitio de unión que es capaz de unirse a un segundo reactivo enpresencia del analito;

(ii) introducir el segundo reactivo que tiene un sitio de unión que es capaz de unirse al primer reactivo enpresencia del analito y que tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber radiaciónelectromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa y que está seleccionado entreuna partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, unamolécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, unananopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, uneritrocito y sus combinaciones, en el que el primer o el segundo anticuerpo es capaz de unirse al analito;

(iii) exponer la muestra al transductor permitiendo de este modo que el analito se una bien al primer o alsegundo reactivo;

(iv) introducir un reactivo de enmascaramiento que sea capaz de unirse al mismo primer o segundo reactivo queel analito evitando de este modo la unión del primer reactivo al segundo reactivo;

(v) irradiar la muestra con radiación electromagnética;

(vi) transformar la energía generada en una señal eléctrica; y

(vii) detectar la señal eléctrica, en el que las etapas (ii) a (iv) puede ocurrir en cualquier orden.

Procedimiento para detectar una sustancia química La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar una sustancia química y, en particular, a un inmunoensayo que emplea un dispositivo de detección química que contiene un transductor.

Un inmunoensayo es un ensayo que mide la presencia o más normalmente la concentración de un analito en un fluido biológico. Típicamente, implica la unión específica de un antígeno a un anticuerpo. El anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, teniendo los anticuerpos monoclonales diferentes ventajas, que incluyen reproducibilidad de fabricación y contención de una unión a un epitopo de un analito. Con el fin de proporcionar una medición cuantificable de la concentración del analito, se compara la respuesta con muestras patrón de concentración conocida. Se puede determinar la concentración del anticuerpo o antígeno por medio de una variedad de procedimientos, aunque uno de los más comunes es marcar bien el antígeno o bien el anticuerpo y detectar la presencia del marcador.

Los inmunoensayos pueden ser competitivos o no competitivos. En un inmunoensayo competitivo, el antígeno de la muestra desconocida compite con el antígeno marcado (el "indicador") para unirse a los anticuerpos, que están típicamente inmovilizados sobre una fase sólida. Posteriormente, se mide la cantidad de antígeno marcado unido al sitio del anticuerpo, normalmente por medio de separación y medición del antígeno marcado unido a la fase sólida. Claramente, la respuesta será inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra desconocida. En un principio de ensayo análogo, el anticuerpo marcado de la solución compite con el antígeno inmovilizado sobre la fase sólida y que se encuentra presente en la muestra, dando lugar a una proporcionalidad inversa similar. En un inmunoensayo no competitivo, también denominado como ensayo inmunométrico, el antígeno de la muestra desconocida se une a un exceso de anticuerpos inmovilizados (los anticuerpos de "captura") y se mide la cantidad de antígeno unido. A diferencia del procedimiento competitivo, los resultados del procedimiento no competitivo serán directamente proporcionales a la concentración de antígeno. En el denominado ensayo "inmunométrico", también denominado "ensayo de sándwich", el antígeno se une al sitio de anticuerpo de captura, y posteriormente se introduce el antígeno marcado que se une al antígeno unido al anticuerpo de captura. Posteriormente, se mide la cantidad de anticuerpo marcado en el sitio.

En un inmunoensayo de sándwich típico, se une un anticuerpo específico para un antígeno de interés a un soporte polimérico tal como una lámina de poliestireno. Se coloca una gota de la muestra objeto de ensayo, por ejemplo un extracto celular o una muestra de suero u orina, sobre la lámina, que se lava tras la formación del complejo anticuerpo-antígeno. Posteriormente, se añade un anticuerpo específico para un sitio diferente del antígeno, y se lava de nuevo el soporte. Este segundo anticuerpo transporta un marcador (el indicador marcado) de manera que se pueda detectar con elevada sensibilidad. La cantidad del segundo anticuerpo unido a la lámina es proporcional a la cantidad de antígeno de la muestra. Este ensayo y otras variaciones de este tipo de ensayo resultan bien conocidos, véase, por ejemplo, "The Immunoassay Handbook, 2nd Ed.", David Wild, Ed., Nature Publishing Group, 2001.

Los inmunoensayos de este tipo funcionan particularmente bien para analitos de masa molecular grande, principalmente porque se puede abordar dos o más epítopos; las áreas de complementariedad entre analito y anticuerpo son relativamente grandes y tienen lugar diferencias relativamente grandes entre analitos, por ejemplo, por medio de al menos un amino ácido de los péptidos. Con inmunoensayo de molécula pequeña (en ocasiones denominada "hapteno", que es una molécula pequeña que, cuando se une a un vehículo grande tal como una proteína, puede inducir una respuesta inmunológica) , la ausencia de dos epítopos prohíbe la formación de un "sándwich". Esto ha servido de motivación para el desarrollo de técnicas adicionales.

Una técnica de inmunoensayo relativamente nueva es el denominado ensayo "imunométrico de anticuerpo selectivo" que está diseñado para mejorar la especificidad y la sensibilidad de la detección de moléculas pequeñas (véase, por ejemplo, N. Kobayashi y J. Goto, en Advancés in Clinical Chemistr y , Vol. 36, Ed. H.E. Spiegel y col., Academic Press, 2001, páginas 139-170 y en particular en la sección 3, 3 en las páginas 155-158) . El inmunoensayo también tiene la desventaja de que proporciona una relación directa entre la concentración del analito y la señal, en lugar de la relación inversa comúnmente observada en los inmunoensayos competitivos.

El protocolo está basado en el enmascaramiento de los sitios del anticuerpo ocupados con una molécula marcada con hapteno múltiple para permitir la determinación selectiva posterior de anticuerpos ocupados con hapteno. En primer lugar, los anticuerpos anti-hapteno se inmovilizan sobre (se unen a) un soporte sólido. A continuación, se expone el soporte a una muestra que contiene el analito desconocido (hapteno) y una macromolécula múltiple conjugada al hapteno. El analito y la macromolécula compiten posteriormente por los sitios de unión de los anticuerpos anti-hapteno sobre el soporte sólido. Se puede introducir el analito antes que la macromolécula, o se pueden introducir simultáneamente y se dejan competir por la superficie o, en el caso en el que la macromolécula se una reversiblemente a la superficie, se puede introducir la macromolécula antes que el analito. Posteriormente, se une un anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario se une a los anticuerpos primarios que no están unidos a la macromolécula. Debido a que la proporción de anticuerpo primario que no está unido a la macromolécula es directamente proporcional a la cantidad de analito, el ensayo proporciona una determinación de la cantidad de analito presente en la muestra.

Se ha observado que esto es muy sensible y específico pero, tal y como se practica actualmente, requiere un número de etapas de incubación y lavado, para eliminar de la manera más importante el exceso de marcaje no unido antes de la determinación de la cantidad de anticuerpo marcado presente. Esto añade complejidad significativamente al ensayo y limita sustancialmente la aplicabilidad de la técnica.

El documento WO 2004/090512 desvela un dispositivo para detectar la energía generada por la desintegración no radiativa generada por una sustancia tras la irradiación con radiación electromagnética. Wu y col., Clinica Chimica Acta, 2006, 369, 119-124 desvela el pasado seleccionado y el futuro del desarrollo de inmunoensayos y aplicaciones en química clínica. N. Kubayashi y J. Goto, Academic Press, 2001, 139-170 desvela inmunoensayos no competitivos para moléculas pequeñas con elevada sensibilidad y especificidad.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

Un procedimiento para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un transductor que comprende un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica, y un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, en el que el primer reactivo tiene un sitio de unión que es capaz de unirse a un segundo reactivo en presencia del analito;

(ii) introducir el segundo reactivo, presentando el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al primer reactivo en presencia del analito y que tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber la radiación electromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa y que está seleccionado entre una partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones, en el que bien el primer o bien el segundo reactivo son capaces de unirse al analito,

(iii) exponer la muestra al transductor permitiendo de este modo que el analito se una bien al primer o bien al segundo reactivo;

(iv) introducir un reactivo de enmascaramiento que sea capaz de unirse al mismo primer o segundo reactivo como el analito, evitando de este modo la unión del primer reactivo al segundo... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar un analito en una muestra, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar un transductor que comprende un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos que es capaz de transformar un cambio de energía en una señal eléctrica, y un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, en el que el primer reactivo tiene un sitio de unión que es capaz de unirse a un segundo reactivo en presencia del analito;

(ii) introducir el segundo reactivo que tiene un sitio de unión que es capaz de unirse al primer reactivo en presencia del analito y que tiene un marcador unido al mismo que es capaz de absorber radiación electromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa y que está seleccionado entre una partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones, en el que el primer o el segundo anticuerpo es capaz de unirse al analito;

(iii) exponer la muestra al transductor permitiendo de este modo que el analito se una bien al primer o al segundo reactivo;

(iv) introducir un reactivo de enmascaramiento que sea capaz de unirse al mismo primer o segundo reactivo que el analito evitando de este modo la unión del primer reactivo al segundo reactivo;

(v) irradiar la muestra con radiación electromagnética;

(vi) transformar la energía generada en una señal eléctrica; y

(vii) detectar la señal eléctrica, en el que las etapas (ii) a (iv) puede ocurrir en cualquier orden.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer y segundo reactivos son anticuerpos.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que se introduce el agente de enmascaramiento en sustancialmente el mismo instante que la muestra.

4. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el transductor se encuentra ubicado en una cámara de muestra.

5. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra contiene partículas suspendidas.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que la muestra es sangre.

7. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que la fuente de radiación está adaptada para generar una serie de pulsos de radiación electromagnética y el detector está adaptado para determinar el retardo temporal entre cada pulso de radiación electromagnética de la fuente de radiación y la generación de la señal eléctrica.

8. Un procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que el procedimiento se lleva a cabo sin retirar la muestra del transductor entre las etapas de exposición de la muestra al transductor e irradiación de la muestra.

9. Un kit que comprende (i) un dispositivo para detectar un analito en una muestra que comprende un transductor que tiene un elemento piroeléctrico o piezoeléctrico y electrodos, que es capaz de trasformar un cambio de energía en una señal eléctrica; un primer reactivo inmovilizado sobre el transductor, teniendo el primer reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al segundo reactivo en presencia del analito; (ii) un segundo reactivo, teniendo el segundo reactivo un sitio de unión que es capaz de unirse al primer reactivo en presencia del analito y teniendo un marcador unido al mismo que es capaz de absorber radiación electromagnética para generar energía por medio de desintegración no radiativa y que está seleccionado entre una partícula de carbono, una partícula polimérica coloreada, una molécula de colorante, una enzima, una molécula fluorescente, una partícula metálica, una molécula de hemoglobina, una partícula magnética, una nanopartícula que tiene un material de núcleo no conductor y al menos una capa de cubierta metálica, un eritrocito y sus combinaciones y (iii) un reactivo de enmascaramiento que es capaz de unirse al mismo primer o segundo reactivo que el analito, evitando de este modo la unión del primer reactivo al segundo reactivo.

10. Un kit según la reivindicación 9, en el que el primer y segundo reactivos son anticuerpos.

11. Un kit según las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el dispositivo además comprende una cámara de muestra y el transductor se encuentra ubicado en la cámara de muestra.

12. Un kit según la reivindicación 11, en el que el transductor está integrado con la cámara.

13. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la fuente de radiación está adaptada para generar una serie de pulsos de radiación electromagnética y el detector está adaptado para determinar el retardo temporal entre cada pulso de radiación electromagnética de la fuente de radiación y la generación de la señal eléctrica.