Un marcador para medir cirrosis hepática.

Un método para detectar cirrosis hepática en un mamífero, que comprende:

a) generar un perfil del conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina o de dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina que se ha marcado; estando presentes en u obteniéndose dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina a partir del conjunto de (gluco)proteínas totales que están presentes en o se aíslan a partir de una muestra de suero o de plasma sanguíneo derivada de dicho mamífero, y

b) medir en el perfil de la etapa a) la cantidad de al menos un hidrato de carbono enlazado a asparagina o dicho hidrato de carbono enlazado a asparagina que se ha marcado, y

c) comparar los datos medidos obtenidos en la etapa b) con los datos medidos obtenidos a partir de perfiles derivados de mamíferos libres de cirrosis hepática, y

d) atribuir la desviación obtenida en la etapa c) a cirrosis hepática.

Un marcador para medir cirrosis hepática Campo de la invención

La invención proporciona métodos y kits para detectar cirrosis hepática en mamíferos. El ensayo de diagnóstico se basa en la elaboración del perfil e identificación de hidratos de carbono de diagnóstico presentes en un fluido corporal tal como suero sanguíneo.

Antecedentes de la invención

La mayoría de las causas comunes de lesión hepática dan como resultado cirrosis. La cirrosis es la destrucción del tejido hepático normal que deja tejido cicatrizal que no funciona alrededor de áreas de tejido hepático que funciona, acompañada de la formación de nodulos hepáticos regenerativos. En los Estados Unidos de América, la causa más común de cirrosis es abuso de alcohol. Entre personas con edades de 45 a 65, la cirrosis es la tercera causa más común de muerte, tras cardiopatía y cáncer. En muchas partes de Asia y África, la hepatitis crónica es una causa principal de cirrosis. Muchas personas con cirrosis leve no tienen síntomas y parecen estar bien durante años. Otras son débiles, tienen poco apetito, se sienten enfermas, y pierden peso. Si el flujo biliar está crónicamente obstruido, la persona tiene ictericia, prurito, y pequeños nodulos de la piel amarillos, especialmente alrededor de los párpados. La malnutrición resulta habitualmente de un apetito pobre y la absorción alterada de grasas y vitaminas solubles en grasas provocado por la producción reducida de sales biliares. Ocasionalmente, la persona puede toser o vomitar grandes cantidades de sangre debido a la hemorragia de venas varicosas en el extremo inferior del esófago (varices esofágicas). Estos vasos sanguíneos agrandados resultan de una tensión arterial elevada en las venas que corren desde el intestino hasta el hígado. Tal tensión arterial elevada, denominada hipertensión portal, junto con una mala función hepática, también puede conducir a la acumulación de fluido en el abdomen (ascitis). También se pueden desarrollar insuficiencia renal y encefalopatía hepática. Se pueden desarrollar otros síntomas de hepatopatía de larga duración, tal como debilitamiento muscular, enrojecimiento de las palmas (eritema palmar), curvado de los dedos (contractura de Dupuytren de las palmas), pequeñas venas en la piel semejantes a arañas, agrandamiento de la mama en los hombres (ginecomastia), agrandamiento de la glándula salivar en las mejillas, pérdida del cabello, contracción de los testículos (atrofia testicular), función nerviosa anormal, tanto en el sistema nervioso periférico (neuropatía periférica) como en el sistema nervioso central.

Actualmente no existe cura para la cirrosis. El tratamiento incluye la retirada de agentes tóxicos tales como alcohol, la administración de una nutrición apropiada que incluya vitaminas suplementarias, y el tratamiento de complicación cuando surjan. El transplante hepático es actualmente la única cura, y puede ayudar a una persona con cirrosis avanzada. Además, la presencia de cirrosis aumenta el riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular alrededor de 4 veces con respecto al riesgo en la población general, y, en un fondo etiológico de hepatitis crónica y alcoholismo, el desarrollo de cirrosis multiplica el riesgo ya incrementado del paciente a desarrollar carcinoma hepatocelular de 34,4 a 119 veces y de 2,4 a 22,4 veces, respectivamente (Kuper et al., 21). Habltualmente se lleva a cabo un número de ensayos sanguíneos para medir la función hepática y ayudar a determinar la gravedad y causa de la cirrosis. Uno de los factores más importantes indicativos del daño hepático es la bilirrubina, un pigmento amarillo- rojizo que es metabolizado normalmente en el hígado y después se excreta en la orina. En pacientes con hepatitis, el hígado no puede procesar bilirrubina, y los niveles de sangre de esta sustancia aumentan, provocando algunas veces ictericia. Los niveles de ciertas enzimas hepáticas pueden también ser indicativas de cirrosis (por ejemplo niveles de aspartato y alanlna amlnotransferasa, y varias enzimas de coagulación). Sin embargo, los resultados de estos ensayos de la función hepática a menudo son normales debido a que sólo se necesita un pequeño porcentaje de células hepáticas que funcionan para llevar a cabo las funciones químicas esenciales. Además, se usa un número de ensayos de formación de Imágenes para diagnosticar posible cirrosis y sus complicaciones. Por ejemplo, un barrido con ultrasonidos puede mostrar que el hígado está agrandado y que existen lesiones particulares tales como nodulos regenerativos. Otras técnicas de formación de imágenes, mucho más costosas, son la formación de imágenes mediante resonancia magnética (MRI) y la tomografía computerizada (CT). En la mayoría de los pacientes que presentan alguna forma de trastorno hepático crónico, se lleva a cabo la biopsla hepática para evaluar el grado de fibrosis y detectar la presencia de cirrosis (Fracanzani et al., 21). Puesto que la blopsia hepática es un procedimiento invasivo, generalmente es difícil llevarla a cabo en base a un seguimiento normal en un marco clínico normal. Un marcador sérico específico para la detección de cirrosis hepática podría tener así un impacto muy significativo sobre la práctica gastroenterológlca, permitiendo el seguimiento habitual de pacientes con hepatopatía crónica y proporcionando una advertencia prematura del comienzo de la cirrosis. En el caso particular de alcoholismo crónico, un marcador sérico para la cirrosis podría proporcionar un argumento importante para convencer al paciente de que detenga el alcoholismo.

En la técnica se describe la aplicación de la medición de glucanos de diagnóstico en enfermedades del metabolismo de hidratos de carbono (documento W9219975). En el campo de trastornos hepáticos, también se conoce que las actividades de enzimas de glucosilación individuales cambian en trastornos hepáticos. Por ejemplo, una mayor actividad de la enzima UDP-N-acetil-glucosamina:glucoproteína N-acetilglucosaminiltransferasa (GnTIII) está correlacionada con la progresión de hepatopatía (Ishibashi et al., 1989), un hallazgo que se ha elaborado recientemente en un marco de diagnóstico (Mori et al., 1998). Sin embargo, estos ensayos son complicados por la

separación de los productos de la reacción enzimática mediante HPLC. Además, la estabilidad de la enzima en el suero en condiciones de almacenamiento es desconocida, y los valores obtenidos para la actividad de GnTIII sérica tuvo grandes solapamientos entre cirrosis y hepatitis crónica. Las diferencias de glucosilación también se han estudiado en una proteína purificada, transferrina sérica, y estas diferencias se usan para la detección de alcoholismo crónico (Matsumoto K. et al (1994) Clin. Chim. Acta 224(1): 1-8). El análisis de estructuras de hidratos de carbono de IgG en pacientes que tienen cirrosis hepática se describe en el documento US.698.793. También se han descrito alteraciones en el resto de hidrato de carbono de proteínas purificadas individuales en fluido ascítico cirrótico humano (Biou, D. et al (1987) Biochimica et Biophysica Acta 913, 38-312). Los métodos para la detección de enfermedades hepáticas se describen en las patentes EP53886 y DE3838718. Sin embargo, estas últimas patentes se refieren a la cuantificación de hidratos de carbono simples (fucosa) en orina. A la vista de la técnica anterior, actualmente no hay ningún marcador sérico fiable, fácilmente medible, para la diferenciación de cirrosis hepática de otros trastornos hepáticos. En la presente invención, se han identificado múltiples parámetros de hidratos de carbono de diagnóstico derivados del conjunto de proteínas presentes en el suero de pacientes cirróticos. En el suero, existe una mezcla compleja de proteínas glucosiladas y no glucosiladas que derivan de células hepáticas y del plasma. Inesperadamente, se ha encontrado que cantidades (relativas) de hidratos de carbono de diagnóstico presentes en una mezcla de glucoproteínas, que están presentes en el suero total, sirven como marcador de diagnóstico para la diferenciación de pacientes con cirrosis hepática de pacientes con hepatitis crónica, y para la diferenciación de cirrosis hepática de otros trastornos hepáticos no malignos y malignos. Una ventaja de analizar el conjunto de glucoproteínas séricas totales es que la cantidad de trabajo requerida para la preparación de las muestras se reduce al mínimo. Esto permite el análisis de números clínicamente relevantes de pacientes.

Breve descripción de figuras y tablas Fig. 1 Ejemplos de perfil

El panel superior contiene un hidrolizado de dextrano y se puede usar para asignar un valor de unidades de glucosa a cada pico. El segundo panel muestra un electroferograma típico de los N-glucanos... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar cirrosis hepática en un mamífero, que comprende:

a) generar un perfil del conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina o de dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina que se ha marcado; estando presentes en u obteniéndose dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina a partir del conjunto de (gluco)proteínas totales que están presentes en o se aíslan a partir de una muestra de suero o de plasma sanguíneo derivada de dicho mamífero, y

b) medir en el perfil de la etapa a) la cantidad de al menos un hidrato de carbono enlazado a asparagina o dicho hidrato de carbono enlazado a asparagina que se ha marcado, y

c) comparar los datos medidos obtenidos en la etapa b) con los datos medidos obtenidos a partir de perfiles derivados de mamíferos libres de cirrosis hepática, y

d) atribuir la desviación obtenida en la etapa c) a cirrosis hepática.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un hidrato de carbono enlazado a asparagina se selecciona del grupo que consiste en:

i) GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,3)[GlcNAc(P-1,2)Man(oc-1,6)]Man(P-1,4)GlcNAc(P-1,4)[Fuc(a-1,6)]GlcNAc (glucano

1),

¡i) GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,3)[GlcNAc(P-1,4)][GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,6)]Man(P-1,4)GlcNAc(P-1,4)[Fuc(a-

1,6)]GlcNAc (glucano 2),

iii) Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,3)[Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,6)]Man(P-1,4)GlcNAc(P-1,4)GlcNAc (glucano 3),

iv) Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,3)[GlcNAc(P-1,4)][Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,6)]Man(|3-

1.4) GlcNAc(P-1,4)[Fuc(a-1,6)]GlcNAc (glucano 7),

v) Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)[Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,4)]Man(a-1,3)[Gal(P-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,6)]Man(P-

1.4) GlcNAc(P-1,4)GlcNAc (glucano 8),

vi) un derivado sialilado de glucano 1,2, 3, 7 u 8,

3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicha cantidad se mide como una cantidad relativa entre glucano 1 y glucano 8 y/o glucano 2 y glucano 8 y/o glucano 7 y glucano 8 y/o glucano 1 y glucano 3 y/o glucano 2 y glucano 3 y/o glucano 7 y glucano 3.

4. El método según la reivindicación 3, en el que dicha cantidad relativa entre glucano 1 y glucano 8 es al menos 8% mayor que el promedio de dicha cantidad relativa en mamíferos libres de cirrosis hepática.

5. El método según la reivindicación 3, en el que dicha cantidad relativa entre glucano 2 y glucano 8 es al menos 1% mayor que el promedio de dicha cantidad relativa en mamíferos libres de cirrosis hepática.

6. El método según la reivindicación 3, en el que dicha cantidad relativa entre glucano 7 y glucano 8 es al menos 4% mayor que el promedio de dicha cantidad relativa en mamíferos libres de cirrosis hepática.

7. Un método según las reivindicaciones 1-6, en el que dicho mamífero es un ser humano.

8. Un método para el diagnóstico de cirrosis hepática en un mamífero según las reivindicaciones 1-7, que comprende además otras evaluaciones cuantitativas o cualitativas de la condición física del mamífero, tales como parámetros de química clínica y datos histológicos.

9. Un método para detectar la presencia o la predisposición de carcinoma hepatocelular en un mamífero que sufre cirrosis hepática, que comprende:

a) generar un perfil del conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina, o dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina que se ha marcado; estando presentes en u obteniéndose dicho conjunto de hidratos de carbono enlazados a asparagina a partir del conjunto de (gluco)proteínas totales que están presentes en o se aíslan a partir de una muestra de suero o de plasma sanguíneo procedente de dicho mamífero, y

b) medir en el perfil de la etapa a) la cantidad de al menos un hidrato de carbono enlazado a asparagina o de dicho hidrato de carbono enlazado a asparagina que se ha marcado, y

c) comparar los datos medidos obtenidos en la etapa b) con los datos medidos obtenidos a partir de perfiles derivados de mamíferos que sufren cirrosis hepática pero están libres de carcinoma hepatocelular, y

d) atribuir la desviación obtenida en la etapa c) a la presencia de carcinoma hepatocelular.

1. Un método según la reivindicación 9, en el que al menos un hidrato de carbono enlazado a asparaglna citado en 5 la etapa b) comprende Gal(p-1,4)GlcNAc(P-1,2)Man(a-1,3)[GlcNAc(P-1,4)][Gal(P-1,4)GlcNAc((5-1,2)Man(a- 1,6)]Man(P-1,4)GlcNAc(P-1,4)[Fuc(a-1,6)]GlcNAc (glucano 7).