Proteína de fusión que se puede escindir proteolíticamente que comprende un factor de coagulación sanguínea.

Proteína de fusión terapéutica que comprende

a) un factor de coagulación,

b) un polipéptido que alarga la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albúmina incluyendo variantes y derivados de la misma, polipéptidos de la familia de la albúmina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de unión a antígenos, y

c) un enlazador peptídico que une el factor de coagulación y el extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido que alarga la semivida de modo que el enlazador peptídico escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulación y el polipéptido que alarga la semivida;

en donde el enlazador peptídico se puede escindir con proteasas implicadas en la coagulación o activadas por enzimas de la coagulación y en donde la proteína de fusión terapéutica tiene en comparación con la proteína de fusión terapéutica respectiva unida por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoácidos GGGGGGV, un aumento de la actividad específica molar en al menos un ensayo relacionado con la coagulación y en donde la actividad específica molar se incrementa en al menos el 100%.

Proteïna de fusiïn que se puede escindir proteolïticamente que comprende un factor de coagulaciïn sanguïnea

Introducciïn La presente invenciïn se refiere al campo de las proteïnas de fusiïn terapïuticas, modificadas con una semivida incrementada en comparaciïn con sus polipïptidos terapïuticos parentales no modificados. La invenciïn se refiere especïficamente a factores de coagulaciïn fusionados con polipïptidos que alargan la semivida (HLEPs) , que estïn conectados por pïptidos enlazadores que se pueden escindir proteolïticamente, de modo que el pïptido enlazador escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulaciïn y el polipïptido que alarga la semivida. La escisiïn de tales enlazadores libera el polipïptido terapïutico de cualquier impedimento estïrico que afecta a la actividad, causado por el HLEP y por lo tanto permite la generaciïn de proteïnas de fusiïn que conservan una actividad especïfica molar elevada del factor de coagulaciïn. En caso de que las proteïnas de fusiïn terapïuticas sean zimïgenos, se prefieren especialmente los enlazadores que liberan el polipïptido terapïutico esencialmente de forma simultïnea con su activaciïn in vivo, despuïs de la exposiciïn a la (s) proteasa (s) correspondiente (s) .

La idea de la invenciïn se demuestra, en particular, a travïs de polipïptidos humanos dependientes de la vitamina K, Factor IX, Factor VII y Factor VIIa, pero el concepto tambiïn se puede aplicar a otros factores de coagulaciïn. Cualquier polipïptido que alarga la semivida (HLEP) puede estar conectado con el polipïptido terapïutico a travïs de un pïptido enlazador escindible, pero la albïmina o inmunoglobulinas sin un dominio de uniïn a antïgenos, como el fragmento Fc sin un dominio de uniïn a antïgenos, son los HLEPs preferidos. La invenciïn tambiïn se refiere a secuencias de ADNc que codifican los polipïptidos terapïuticos y a derivados de los mismos fusionados genïticamente con un ADNc que codifica HLEPs, tal como albïmina de suero humano ligada a oligonucleïtidos que codifican enlazadores peptïdicos escindibles intercalados. Tales derivados codificados muestran una mejora de las actividades especïficas molares y de la semivida que se incrementan en comparaciïn con sus homïlogos no escindibles. La invenciïn tambiïn se refiere a vectores de expresiïn recombinantes que contienen tales secuencias de ADNc, a cïlulas hospedadoras transformadas con tales vectores de expresiïn recombinantes, a polipïptidos recombinantes y a derivados que tienen actividades biolïgicas comparables a la del polipïptido terapïutico de tipo silvestre no modificado pero que tienen semividas mejoradas. La invenciïn tambiïn se refiere a procedimientos para la preparaciïn de tales proteïnas recombinantes y sus derivados. La invenciïn tambiïn incluye un vector de transferencia para uso en terapia gïnica humana, que comprende tales secuencias de ADN modificadas, ïtiles para incrementar la semivida in vivo.

Antecedentes de la invenciïn Varios polipïptidos terapïuticos recombinantes estïn disponibles comercialmente para uso terapïutico y profilïctico en los seres humanos. Los pacientes se benefician en general del modo especïfico de acciïn de los ingredientes activos recombinantes, pero una desventaja es frecuentemente su limitada disponibilidad debido a sus procedimientos de preparaciïn costosos y complejos. Una reducciïn de la dosis requerida o de la frecuencia de administraciïn de tales productos, podrïa mejorar esta situaciïn. Una frecuencia de administraciïn reducida podrïa mejorar la comodidad del paciente y, por lo tanto, tambiïn la aceptaciïn de la terapia. Se han descrito diversas soluciones para lograr el objetivo de una semivida in vivo mïs larga despuïs de la administraciïn. Las soluciones propuestas recientemente incluyen la formaciïn de proteïnas de fusiïn, especialmente en el caso de polipïptidos con una semivida corta in vivo que se puede alargar significativamente mediante la fusiïn con un HLEP.

Ballance et al. (documento WO 01/79271) describen polipïptidos de fusiïn de una multitud de diferentes polipïptidos terapïuticos que, cuando se fusionan con la albïmina de suero humano, se prevï que tengan una semivida funcional incrementada in vivo y una vida ïtil prolongada. Se han descrito largas listas de posibles ligandos de la fusiïn sin que los datos experimentales muestren para casi ninguno de estos polipïptidos que las proteïnas de fusiïn de albïmina respectivas, realmente conservan la actividad biolïgica y tienen propiedades mejoradas. Entre la lista de polipïptidos terapïuticos mencionados como Ejemplos estïn el Factor IX y FVII/FVIIa. Tambiïn se describen las fusiones de FIX y de FVII/FVIIa en las que hay un enlazador peptïdico entre la albïmina y FIX o FVII/FVIIa. Sin embargo, no se sugiere el uso de pïptidos enlazadores escindibles.

Sheffield et al. (Sheffield W.P. et al. (2004) , Br. J. Haematol. 126: 565-573) expresaron una proteïna de fusiïn de albïmina y Factor IX murino, compuesta de FIX murino, un enlazador de 8 aminoïcidos (GPG4TM) , albïmina murina y un marcador peptïdico de 22 aminoïcidos, y tambiïn una proteïna de fusiïn de albïmina y Factor IX humano compuesta de Factor IX humano, un enlazador de 7 aminoïcidos (G6V) y albïmina humana. Empleando un ensayo de coagulaciïn de una sola etapa, dependiente de FIX, las actividades especïficas molares de la proteïna de fusiïn FIX-albïmina murina (MFUST) y la proteïna de fusiïn FIX-albïmina humana (HFUS) eran al menos de dos a tres veces menores que las de sus homïlogos no fusionados, un efecto atribuido, al menos parcialmente a un proceso de activaciïn proteolïtica mïs lenta mediante FXIa. Sheffield no utilizï ni sugiriï el uso de un enlazador escindible entre FIX y la albïmina.

Varias solicitudes de patente describen la fusiïn de polipïptidos terapïuticos con regiones constantes de inmunoglobulinas para extender la semivida in vivo del polipïptido terapïutico. Los documentos WO 2002/04598, WO

2003/059935, WO 2004/081053, WO 2004/101740 y WO 2005/001025 incluyen FIX como ejemplo del resto de polipïptido terapïutico. Las dos ïltimas solicitudes de patentes tambiïn describen FVII/FVIIa fusionados con regiones constantes de inmunoglobulinas y se observï que los homodïmeros de proteïnas de fusiïn tienen una actividad de coagulaciïn inferior, en comparaciïn con proteïnas de fusiïn que consistïan en un monïmero/dïmero. Una vez mïs, no se sugiere el uso de pïptidos enlazadores escindibles.

En el documento WO 91/09125 se describen proteïnas de fusiïn que se unen a travïs de enlazadores que son escindibles con proteasas de la cascada de la coagulaciïn sanguïnea, pero las proteïnas de fusiïn se limitan a las que comprenden proteïnas fibrinolïticas o antitrombïticas.

En el documento WO 03/068934 se describen molïculas quimïricas que se componen de al menos una primera molïcula de componente, al menos un enlazador y al menos una segunda molïcula, en donde el enlazador comprende un sitio de escisiïn enzimïtica para producir una uniïn de origen no natural y un sitio de escisiïn entre la primera y la segunda molïcula de componente y en donde, despuïs de la escisiïn de la molïcula quimïrica en el sitio de escisiïn, al menos una de las molïculas de componente es funcionalmente activa. Las proteasas que escinden pueden ser factores de coagulaciïn, como la trombina. Las molïculas de componente descritas son entre muchas otras FIX y FVIIa. Sin embargo, las proteïnas de fusiïn terapïuticas de la presente invenciïn no se describen, ni se describen propiedades mejoradas de las proteïnas de fusiïn terapïuticas de la presente invenciïn, tales como el aumento de la actividad especïfica molar, el aumento de las tasas de inactivaciïn y/o eliminaciïn en comparaciïn con la proteïna terapïutica sin enlazadores escindibles.

Descripciïn de la invenciïn Existe una gran necesidad mïdica de factores de coagulaciïn que tengan una semivida larga. En la tïcnica anterior se han sugerido fusiones de factores de coagulaciïn con polipïptidos que alargan la semivida, para lograr este objetivo. Sin embargo, una vez que un factor de coagulaciïn se activa durante la coagulaciïn, ya sea mediante escisiïn proteolïtica del zimïgeno (como FIX) o por contacto de un factor que ya estï proteolïticamente "pre"-activado con un segundo polipïptido (como FVIIa que se une al factor tisular) , ya no es deseable mantener la larga semivida del factor de coagulaciïn que estï ahora activado, ya que esto podrïa dar lugar a complicaciones trombïticas, como ya es el caso para un factor de coagulaciïn de tipo silvestre, tal como FVIIa (Aledort L.M., J Thromb Haemost 2 (10) : 17001708 (2004) ) y debe ser... [Seguir leyendo]

1. Proteïna de fusiïn terapïutica que comprende a) un factor de coagulaciïn,

b) un polipïptido que alarga la semivida seleccionado entre el grupo que consiste en albïmina incluyendo variantes y derivados de la misma, polipïptidos de la familia de la albïmina incluyendo variantes y derivados de los mismos e inmunoglobulinas sin el domino de uniïn a antïgenos, y

c) un enlazador peptïdico que une el factor de coagulaciïn y el extremo N-terminal o C-terminal del polipïptido que alarga la semivida de modo que el enlazador peptïdico escindible intercalado se introduce entre el factor de coagulaciïn y el polipïptido que alarga la semivida;

en donde el enlazador peptïdico se puede escindir con proteasas implicadas en la coagulaciïn o activadas por enzimas de la coagulaciïn y en donde la proteïna de fusiïn terapïutica tiene en comparaciïn con la proteïna de fusiïn terapïutica respectiva unida por un enlazador no escindible que tiene la secuencia de aminoïcidos GGGGGGV, un aumento de la actividad especïfica molar en al menos un ensayo relacionado con la coagulaciïn y en donde la actividad especïfica molar se incrementa en al menos el 100%.

2. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn la reivindicaciïn 1, en donde el factor de coagulaciïn es un factor de coagulaciïn dependiente de la vitamina K.

3. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 2, en donde el factor de coagulaciïn es FVIIa

o FIX.

4. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polipïptido que alarga la semivida es una inmunoglobulina sin un dominio de uniïn a antïgenos.

5. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 4, en donde el enlazador se puede escindir con FXIa y/o FVIIa/TF.

6. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 5, en donde el enlazador se puede escindir con la proteasa o proteasas que activan el factor de coagulaciïn.

7. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn la reivindicaciïn 6, en donde la cinïtica de la escisiïn del enlazador con la proteasa o proteasas no se retrasa, en comparaciïn con la cinïtica de la activaciïn de dicho factor de coagulaciïn en mïs de un factor 3.

8. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn la reivindicaciïn 7, en donde el enlazador se puede escindir con la proteasa o proteasas que se activan despuïs de la implicaciïn del factor de coagulaciïn.

9. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 8, en donde el enlazador se puede escindir con FXIa y/o FVIIa/TF y el factor de coagulaciïn es FIX.

10. Proteïna de fusiïn terapïutica segïn las reivindicaciones 1 a 9, en donde el enlazador se puede escindir con FXa y/o FVIIa/TF y el factor de coagulaciïn es FVIIa.

11. Proteïna (s) de fusiïn terapïutica segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el enlazador comprende una secuencia seleccionada entre el grupo de las tablas 3a and 3b en donde los enlazadores RI, GGGGGGV, (GGS) nGS, SS (GGS) 7GS y SSNGS (GGS) 3NGS (GGS) 3GGNGS estïn excluidos.

12. Proteïna (s) de fusiïn terapïutica segïn cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para uso como medicamento.

13. Un polinucleïtido que codifica una proteïna de fusiïn terapïutica segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un plïsmido o un vector que comprende un ïcido nucleico segïn la reivindicaciïn 13.

15. Una cïlula hospedadora que comprende un polinucleïtido segïn la reivindicaciïn 13 o un plïsmido o un vector segïn la reivindicaciïn 14.

16. Un mïtodo para producir una proteïna de fusiïn terapïutica segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende cultivar cïlulas hospedadoras segïn la reivindicaciïn 15 en condiciones tales que se expresa la proteïna de fusiïn terapïutica.

17. Una composiciïn farmacïutica que comprende una proteïna de fusiïn terapïutica segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleïtido segïn la reivindicaciïn 13, o un plïsmido o un vector segïn la reivindicaciïn 14.

18. El uso de una proteïna de fusiïn terapïutica segïn una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, de un polinucleïtido segïn la reivindicaciïn 13, o de un plïsmido o un vector segïn la reivindicaciïn 14, o de una cïlula hospedadora segïn la reivindicaciïn 15, para la preparaciïn de un medicamento para el tratamiento o la prevenciïn de un trastorno de la coagulaciïn sanguïnea.

19. El uso segïn la reivindicaciïn 18, en donde el trastorno de la coagulaciïn sanguïnea es hemofilia B, una deficiencia en FVII y/o FVIIa o hemofilia A.

20. El uso segïn una cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, en donde el tratamiento comprende terapia gïnica humana.