Preparación fermentativa de lisina.

Procedimiento para la preparación de lisina mediante fermentación,

que comprende los siguientes pasos:

a1) molienda de granos de cereales como fuente de almidón con obtención de un producto molido que contiene al menos el 50 % en peso de los constituyentes sólidos que no contienen almidón contenidos en los granos de cereales molidos, ascendiendo la parte de los constituyentes sólidos que no contienen almidón en el producto molido al menos al 15 % en peso;

a2) suspensión del producto molido en un líquido acuoso e hidrólisis de la parte de almidón en el producto molido mediante licuefacción enzimática y, dado el caso, sacarificación posterior, obteniéndose un primer líquido (1) que contiene mono- u oligosacáridos, que contiene los constituyentes sólidos que no contienen almidón del producto molido y en el que la concentración total de mono-, di- y oligosacáridos se encuentra en el intervalo de 100 a 400 g/kg; y

b) adición del líquido (1) que contiene mono- u oligosacáridos junto con mono-, di- y/u oligosacáridos metabolizables o una composición que contiene mono-, di- y/u oligosacáridos metabolizables en una concentración de al menos el 50 % en peso y que esencialmente está exenta de sólidos insolubles en agua, a un medio de fermentación que contiene un microorganismo que está capacitado para la sobreproducción de la lisina en condiciones de fermentación,

aumentándose la concentración total de mono-, di- y oligosacáridos en el primer líquido (1) mediante adición de mono-, di- y/u oligosacáridos metabolizables o mediante adición de un medio que contiene mono-, di- y/u oligosacáridos metabolizables en una concentración de al menos el 50 % en peso y que está esencialmente libre de sólidos insolubles en agua, en al menos 50 g/kg.

Preparaciïn fermentativa de lisina La presente invenciïn se refiere a la preparaciïn fermentativa de lisina mediante el empleo de un medio que contiene azïcar, que comprende al menos una parte de los constituyentes sïlidos que no contienen almidïn de la fuente de almidïn, para el cultivo de los microorganismos.

Los medios lïquidos que contienen azïcar son una fuente fundamental de nutrientes para muchos procedimientos de fermentaciïn; las partes de azïcar contenidas en los medios se metabolizan por los microorganismos empleados, obteniïndose productos de valor orgïnicos. La diversidad de productos metabïlicos microbianos preparados de este modo, es decir, compuestos orgïnicos, en este caso comprende, por ejemplo, compuestos volïtiles de bajo peso molecular tales como etanol, productos metabïlicos no volïtiles tales como aminoïcidos, vitaminas y carotenoides asï como mïltiples sustancias adicionales.

Para tales procedimientos de fermentaciïn microbiana conocidos en general, dependiendo de las distintas condiciones del procedimiento se utilizan distintas fuentes de carbono. Estas van desde sacarosa pura pasando por melaza de remolacha y caïa de azïcar, las denominadas "melazas high test" (melaza de caïa de azïcar invertida) hasta glucosa de hidrolizados de almidïn. Para la preparaciïn biotecnolïgica de L-lisina ademïs se mencionan ïcido acïtico y etanol como co-sustratos que se pueden emplear a gran escala (Pfefferle y col., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 79 (2003) , 59-112) .

Basïndose en las fuentes mencionadas de carbono se han establecido distintos mïtodos y formas de proceder para la preparaciïn fermentativa basada en azïcar de productos metabïlicos microbianos. Con el ejemplo de la L-lisina, los mismos se describen, por ejemplo, por Pfefferle y col. (en el lugar citado) en relaciïn con generaciïn de cepa, desarrollo del procedimiento y producciïn a gran escala.

Una importante fuente de carbono para la preparaciïn fermentativa mediada por microorganismos de productos metabïlicos microbianos es el almidïn. El mismo, en etapas de reacciïn antepuestas, en primer lugar se tiene que licuar y sacarificar antes de que se pueda usar en una fermentaciïn como fuente de carbono. Para esto se obtiene el almidïn de una fuente natural de almidïn tal como patatas, yuca, cereales, por ejemplo, trigo, maïz, cebada, centeno, triticale o arroz habitualmente en forma purificada previamente y a continuaciïn se licua enzimïticamente y se sacarifica para emplearse entonces en la fermentaciïn en sï para la producciïn de los productos metabïlicos deseados.

Ademïs del empleo de fuentes de almidïn purificadas previamente de este modo se ha descrito tambiïn el uso de fuentes no purificadas de almidïn para la preparaciïn de fuentes de carbono para la producciïn fermentativa de productos metabïlicos microbianos. A este respecto, normalmente, las fuentes de almidïn en primer lugar se trituran mediante molienda. El producto molido se somete entonces a una licuefacciïn y sacarificaciïn. Ya que este producto molido contiene de forma natural, ademïs del almidïn, tambiïn una serie de constituyentes que no contienen almidïn, que pueden influir de forma desventajosa en la fermentaciïn, estos constituyentes habitualmente se separan antes de la fermentaciïn. La retirada se puede realizar directamente despuïs de la molienda (documentos WO 02/077252; JP 2001-072701; JP 56-169594; CN 1218111) , despuïs de la licuefacciïn (documentos WO 02/077252; CN 1173541) o despuïs de la sacarificaciïn (documento CN 1266102; Beukema y col.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract) , Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983) , 6; NL8302229) . Sin embargo, en todas las variantes se emplea un hidrolizado de almidïn esencialmente puro en la fermentaciïn.

Frente a esto se describe en el documento US 5.503.750 un procedimiento de fermentaciïn desarrollado especialmente para la preparaciïn de ïcido lïctico mediante el uso de mosto de cereales sacarificado, en el que el ïcido lïctico se separa de forma continua mediante ultrafiltraciïn y posterior nanofiltraciïn y, de este modo, se retira del fermentador. Los retentatos de la ultra- y nanofiltraciïn que contienen azïcar residual no fermentado se devuelven al fermentador.

Los procedimientos mïs nuevos para la preparaciïn fermentativa de compuestos orgïnicos comprenden, en particular, una purificaciïn de las fuentes de almidïn antes de la fermentaciïn, por ejemplo, la purificaciïn de soluciones de almidïn licuadas y sacarificadas (documento JP 57159500) , o facilitan procedimientos que han de posibilitar la preparaciïn de medios de fermentaciïn a partir de recursos renovables (documento EP 1205557) .

Por el contrario, las fuentes no purificadas de almidïn se emplean en gran medida durante la preparaciïn fermentativa de bioetanol. En este caso, las fuentes de almidïn, habitualmente granos enteros de cereales, en primer lugar se muelen en seco y a continuaciïn se hidroliza el constituyente de almidïn de la fuente de almidïn bajo los efectos de enzimas. A este respecto, la hidrïlisis se puede llevar a cabo de forma tanto discontinua, por ejemplo, en reactores de agitaciïn, como continua, por ejemplo, en cocedores de chorro. Se encuentran descripciones correspondientes de procedimientos, por ejemplo, en "The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries", Jaques y col. (ed.) , Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676735, capïtulo 2, pïginas 7 a 23, y en McAloon y col., "Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks", NREL/TP-580-28893, National Renewable Energy Laborator y , octubre de 2000.

Ya que en la preparaciïn fermentativa de bioetanol se obtiene el producto de valor mediante destilaciïn, el empleo de fuentes de almidïn del procedimiento de molienda en seco en forma no purificada previamente no representa ningïn problema serio. Sin embargo, en caso de la aplicaciïn de un procedimiento de molienda en seco para la preparaciïn de otros productos metabïlicos microbianos, la corriente de sïlidos aportada a la fermentaciïn a travïs de la soluciïn de azïcar es problemïtica, ya que la misma puede tener efecto negativo sobre la fermentaciïn, por ejemplo, en vista de la velocidad de transferencia de oxïgeno o la necesidad de oxïgeno de los microorganismos empleados (para esto compïrese con Mersmann, A. y col.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990) , 357-370) y puede dificultar de forma considerable el tratamiento posterior.

Ademïs, mediante la aportaciïn de sïlidos ya durante la preparaciïn de la suspensiïn que contiene almidïn, la viscosidad de la suspensiïn puede alcanzar un valor crïtico, por lo que, por ejemplo, una suspensiïn con mïs del 30 % en peso de harina de maïz en agua no se puede mezclar ya homogïneamente (Industrial Enzymology, 2ï ed., T. Godfrey, S. West, 1996) . Por ello, con un procedimiento convencional la concentraciïn de glucosa estï limitada. Esto, con respecto a la preparaciïn fermentativa de bioetanol, no tiene mïs relevancia en el sentido de que mayores concentraciones, a causa de la toxicidad del producto para las levaduras empleadas para la fermentaciïn, de por sï no se pueden hacer reaccionar de forma oportuna.

En la preparaciïn fermentativa de productos metabïlicos orgïnicos distintos del etanol, en principio es desventajoso suministrar a la fermentaciïn medios que contengan azïcar con reducidas concentraciones de azïcar, debido a que esto conduce a una diluciïn sobreproporcional del caldo de fermentaciïn y, por consiguiente, se reduce la concentraciïn final que se puede conseguir de los productos de valor, lo que, por un lado, causa costes mayores durante su obtenciïn del medio de fermentaciïn y disminuye el rendimiento espacio-tiempo. Estas consideraciones son determinantes en particular para el caso en el que un hidrolizado de almidïn preparado para una producciïn de bioetanol de gran volumen, que presenta de forma convencional reducidas concentraciones de azïcar o glucosa de hasta aproximadamente el 30 o el 33 % en peso, se ha de suministrar parcialmente a una fermentaciïn secundaria de menor volumen para la preparaciïn de otros productos quïmicos.

A causa de las dificultades y las limitaciones expuestas, los procedimientos de molienda en seco, tal como se emplean en gran medida para la preparaciïn de bioetanol, en la preparaciïn fermentativa de productos metabïlicos microbianos distintos del etanol hasta ahora no han adquirido ninguna importancia econïmica sustancial.... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparaciïn de lisina mediante fermentaciïn, que comprende los siguientes pasos:

a1) molienda de granos de cereales como fuente de almidïn con obtenciïn de un producto molido que contiene al menos el 50 % en peso de los constituyentes sïlidos que no contienen almidïn contenidos en los granos de cereales molidos, ascendiendo la parte de los constituyentes sïlidos que no contienen almidïn en el producto molido al menos al 15 % en peso; a2) suspensiïn del producto molido en un lïquido acuoso e hidrïlisis de la parte de almidïn en el producto molido mediante licuefacciïn enzimïtica y, dado el caso, sacarificaciïn posterior, obteniïndose un primer lïquido (1) que contiene mono- u oligosacïridos, que contiene los constituyentes sïlidos que no contienen almidïn del producto molido y en el que la concentraciïn total de mono-, di- y oligosacïridos se encuentra en el intervalo de 100 a 400 g/kg; y b) adiciïn del lïquido (1) que contiene mono- u oligosacïridos junto con mono-, di- y/u oligosacïridos metabolizables o una composiciïn que contiene mono-, di-y/u oligosacïridos metabolizables en una concentraciïn de al menos el 50 % en peso y que esencialmente estï exenta de sïlidos insolubles en agua, a un medio de fermentaciïn que contiene un microorganismo que estï capacitado para la sobreproducciïn de la lisina en condiciones de fermentaciïn,

aumentïndose la concentraciïn total de mono-, di- y oligosacïridos en el primer lïquido (1) mediante adiciïn de mono-, di- y/u oligosacïridos metabolizables o mediante adiciïn de un medio que contiene mono-, di- y/u oligosacïridos metabolizables en una concentraciïn de al menos el 50 % en peso y que estï esencialmente libre de sïlidos insolubles en agua, en al menos 50 g/kg.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, encontrïndose la concentraciïn total de mono-, di- y oligosacïridos del lïquido (1) obtenido en la etapa a2) en el intervalo de 150 a 350 g/kg.

3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, siendo la cantidad, introducida mediante adiciïn del lïquido (1) en la fermentaciïn, de mono-, di- y/u oligosacïridos del 40 al 95 % en peso de la cantidad total de la cantidad introducida en la fermentaciïn de mono-, di- y oligosacïridos.

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 1, aumentïndose la concentraciïn total de mono-, di- y oligosacïridos en el lïquido (1) hasta un valor en el intervalo de 450 a 600 g/kg.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, empleïndose como composiciïn que contiene mono- u oligosacïridos metabolizables un producto secundario de la producciïn de azïcar que contiene glucosa y/o sacarosa y, dado el caso, dextrinas.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicaciïn 5, empleïndose como composiciïn que contiene mono-, di- y/u oligosacïridos metabolizables melaza de la producciïn de azïcar de remolacha.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, hidrolizïndose en la etapa a2) al menos una cantidad parcial del producto molido obtenido en la etapa a1) mediante adiciïn continua o discontinua al lïquido acuoso en condiciones de hidrïlisis.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, calentïndose en la etapa a2) la suspensiïn del producto molido mediante introducciïn de vapor de agua en la suspensiïn a temperaturas por encima de la temperatura de gelatinizaciïn del almidïn contenido en el producto molido.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, reduciïndose la concentraciïn o aislïndose la lisina del caldo de fermentaciïn y retirïndose a continuaciïn en gran medida los constituyentes volïtiles del caldo de fermentaciïn, obteniïndose una composiciïn proteica sïlida o semisïlida.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, retirïndose al menos parcialmente los constituyentes volïtiles del caldo de fermentaciïn sin aislamiento o reducciïn de concentraciïn previos de un producto metabïlico microbiano no volïtil y, dado el caso, sin separaciïn previa de constituyentes volïtiles, obteniïndose una formulaciïn sïlida de un producto metabïlico microbiano no volïtil.