Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09,

en donde la secuencia de nucleótidos comprende un elemento regulador que es operativo en una planta, comprendiendo el elemento regulador un virus del mosaico de caupí (CPMV)-HT.

Partículas similares al virus de la influenza (VLP) que comprenden hemaglutinina Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud PCT No. PCT/CA2009/000032, presentada el 12 de enero del 2009, que es una continuación en parte de, y reivindica prioridad de la solicitud PCT No. PCT/CA2008/001281, presentada el 11 de julio de 2008; que reivindica prioridad de la solicitud canadiense No. 2.615.372 presentada el 21 de enero de 2008; solicitud estadounidense No. 61/022775 presentada el 22 de enero de 2008; solicitud estadounidense No. 60/959414 presentada el 13 de julio de 2007; solicitud estadounidense No. 60/990603 presentada el 27 de noviembre de 2007; y solicitud estadounidense No. 61/013272 presentada el 12 de diciembre de 2007.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de partículas similares a virus. Más específicamente, la presente invención está dirigida a la producción de partículas similares a virus que comprenden antígenos de la influenza.

Antecedentes de la invención La influenza es la causa principal de muerte en los seres humanos debido a un virus respiratorio. Los síntomas comunes incluyen fiebre, dolor de garganta, dificultad para respirar, y dolor muscular, entre otros. Durante la temporada de gripe, los virus de influenza infectan a un 10-20% de la población mundial, lo que se traduce en 250

500.000 muertes al año Los virus de influenza son virus con envoltura que brotan de la membrana plasmática de las células infectadas de mamíferos y aves. Se clasifican en los tipos A, B, o C, con base en las nucleoproteínas y antígenos de proteínas de matriz presentes. Los virus de la influenza tipo A pueden dividirse además en subtipos de acuerdo a la combinación presente de las glicoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) . La HA regula la capacidad del virus para unirse y penetrar la célula huésped. La NA remueve los residuos de ácido siálico terminales de las cadenas de glicano en la célula huésped y proteínas de la superficie viral, que previene la agregación viral y facilita la movilidad de virus. Actualmente, se reconocen 16 subtipos de HA (H1-H16) y 9 de NA (N1-N9) . Cada virus de influenza tipo A presenta un tipo de glicoproteína HA y un tipo de NA. En general, cada subtipo exhibe especificidad de especie; por ejemplo, se sabe que todos los subtipos de HA y de NA infectan a las aves, mientras que se ha demostrado que sólo los subtipos H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 y N7 infectan a los seres humanos (Horimoto 2006; Suzuki 2005 ) . Los virus de influenza que comprenden H5, H7 y H9 se consideran las formas más altamente patógenas del virus de influenza A, y son más susceptibles de causar pandemias futuras.

Las pandemias de influenza son causadas generalmente por virus de influenza altamente virulentos y contagiosos, y pueden conducir a niveles elevados de morbilidad y de mortalidad a nivel mundial. La aparición de nuevos subtipos de influenza A resultó en 4 grandes pandemias en el siglo 20. La gripe española, causada por un virus H1N1, en 1918 -1919 condujo a la muerte a más de 50 millones de personas en todo el mundo entre 1917 y 1920. En la actualidad, el riesgo de la aparición de un nuevo subtipo, o de la transmisión a los seres humanos de un subtipo endémico en animales, está siempre presente. Particularmente preocupante es una forma muy virulenta de influenza aviar (también llamada "gripe aviar") , cuyos brotes han sido reportados en varios países de todo el mundo. En muchos casos, esta gripe aviar puede resultar en tasas de mortalidad cercana al 100% en 48 horas. La propagación del virus de la gripe aviar (H5N1) , identificada por primera vez en Hong Kong en 1997, a otros países de Asia y Europa se ha propuesto que esta vinculada a los patrones migratorios de las aves silvestres.

El método actual de combatir la influenza en los seres humanos es mediante la vacunación anual. La vacuna es generalmente una combinación de varias cepas que se prevé que serán las cepas dominantes para la próxima "temporada de gripe". La predicción es coordinada por la Organización Mundial de la Salud. Generalmente, el número de dosis de vacuna que se producen cada año no es suficiente para vacunar a la población mundial. Por ejemplo, Canadá y Estados Unidos obtienen suficientes dosis de vacunas para inmunizar a aproximadamente un tercio de su población, mientras que sólo el 17% de la población de la Unión Europea puede ser vacunada. Es evidente que la producción mundial actual de la vacuna contra la influenza sería insuficiente frente a una pandemia de gripe mundial. Incluso si la producción anual necesaria de alguna manera pudiera cumplirse en un año determinado, las cepas dominantes cambian de año en año, el almacenamiento a veces poco necesitado en el año no es práctico. Producción económica a gran escala de una vacuna efectiva contra la influenza es de gran interés para el gobierno y la industria privada por igual.

Las reservas del virus para uso en vacunas se producen en huevos fertilizados. Las partículas del virus se recolectan, y para una vacuna viral inactivada, se rompen mediante detergente para inactivación. Las vacunas atenuadas vivas se elaboran a partir de virus de la influenza que se adaptaron para crecimiento a baja temperatura lo que significa que a la temperatura corporal normal, la vacuna está atenuada. Esta vacuna está autorizada en EE.UU. para su uso en personas de 5 a 49 años de edad. Las vacunas de virus completos inactivados se tornan

inocuas mediante inactivación con agentes químicos y han sido producidas en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Todos estos tipos de vacuna muestran algunas ventajas y desventajas específicas. Una ventaja de las vacunas derivadas de virus completos es el tipo de inmunidad inducida por tales vacunas. En general, las vacunas de virus fraccionados inducen una fuerte respuesta de anticuerpos mientras que las vacunas elaboradas a partir de virus completos inducen tanto un anticuerpo (humoral) como una respuesta celular. A pesar de que una respuesta de anticuerpos funcionales es un criterio para obtener la licencia que se correlaciona con la protección inducida por una vacuna, existe una creciente evidencia de que una respuesta de células T también es importante en la inmunidad contra la gripe -esto también puede proporcionar una mejor protección en los ancianos.

Con el fin de inducir una respuesta celular inmune, se desarrollaron vacunas hechas de virus completos. Debido a la alta patogenicidad de la cepa de influenza (por ejemplo, H5N1) , estas vacunas se producen en instalaciones BL3+. Para las cepas de influenza altamente patógenas como la H5N1, algunos fabricantes han modificado la secuencia de gen de la hemaglutinina con el fin de reducir la patogenicidad de la cepa de la influenza y volverla no virulenta y poderla producir más fácilmente en huevos embrionarios o cultivos celulares de mamíferos. Otros también utilizan cepas de influenza más seguras en las que se clonan las secuencias genéticas para las proteínas hemaglutinina y neuraminidasa en una cepa donante de influenza de baja patogenicidad y de alto rendimiento (A/PR/8/34; Quan F-S et al, 2007) . Si bien estos métodos pueden producir vacunas útiles, no proporcionan una solución a la necesidad de producir altos volúmenes en forma rápida y bajo costo de vacunas en la escala necesaria para satisfacer la necesidad mundial en un año normal, y es casi seguro que será insuficiente frente a una pandemia.

Utilizando esta tecnología de genética inversa, también se podría necesitar mutar la secuencia genética de la proteína HA para que sea no virulenta. Para las cepas de influenza de alta patogenicidad, la producción de vacunas de virus completos o bien requiere de procedimientos de confinamiento o las vacunas resultantes no coinciden exactamente con la secuencia genética del virus circulante. En el caso de vacunas vivas atenuadas, todavía hay un riesgo de que la vacuna administrada pueda recombinarse con un virus de influenza del huésped, lo que conduce a un nuevo virus de la influenza.

Si bien este método mantiene el epítopo antigénico y las modificaciones postraduccionales, existen una serie de inconvenientes con este método, incluyendo el riesgo de contaminación debido al uso de virus completos y rendimientos variables dependiendo de la cepa del virus. Niveles de protección por debajo del óptimo pueden provenir de la heterogeneidad genética en el virus debido a su introducción en los huevos. Otras desventajas incluyen una amplia planificación para la obtención de los huevos, riesgos de contaminación debidos a los productos químicos utilizados en la purificación, y largos períodos de producción. También, las personas hipersensibles... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09, en donde la secuencia de nucleótidos comprende un elemento regulador que es operativo en una planta, comprendiendo el elemento regulador un virus del mosaico de caupí (CPMV) -HT.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que la HA comprende un péptido señal nativo o no nativo y/o opcionalmente en donde el péptido señal no nativo es un péptido señal de la proteína disulfuro isomerasa.

3. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una hemaglutinina de la influenza (HA) que tiene al menos el 80% de identidad de secuencia con (HA) del tipo A/California/04/09, en donde el HA comprende un péptido señal de proteína disulfuro isomerasa, operativamente enlazado a una región reguladora activa en una planta.

4. El ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde la secuencia de hemaglutinina de la influenza se selecciona a partir de la SEQ ID NO: 127 y 135.

5. Un método de producción de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta que comprende:

a) introducir el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 en la planta, o porción de la planta, y

b) incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.

6. El método de la reivindicación 5, que comprende además las etapas de c) cosechar la planta, y

d) purificar las VLP, en donde las VLP están en un intervalo de tamaño d.

80. 300 nm.

7. El método de cualquiera de las reivindicacione.

5. 6, en donde en la etapa de introducción (etapa a) , se introduce el ácido nucleico en la planta en una forma transitoria o se introduce el ácido nucleico en la planta de forma tal que sea estable.

8. El método de una cualquiera de las reivindicacione.

5. 7, en donde en la etapa de introducción (etapa a) , se introduce un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteínas chaperonas en la planta, en donde las una o más proteínas chaperonas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de Hsp40 y Hsp70.

9. Un método de producción de partículas similares al virus de la influenza (VLP) en una planta que comprende:

a) proporcionar una planta, o una porción de una planta, que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, y

b) incubar la planta o porción de la planta bajo condiciones que permitan la expresión del ácido nucleico, produciendo de este modo las VLP.

10. Una planta que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4.

11. La planta de la reivindicación 10, que comprende además un segundo ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una proteínas chaperonas operativamente enlazadas a una región reguladora activa en la planta, en donde las una o más proteínas chaperonas se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de Hsp40 y Hsp70.

12. Una partícula similar a un virus (VLP) producida en una planta, comprendiendo la VLP una hemaglutinina del virus de la influenza (HA) codificada por el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, y uno o más de un lípido derivado de una planta y/o opcionalmente teniendo N-glicanos o N-glicanos modificados específicos de la planta.

13. Una partícula similar a virus (VLP) producida por el método de una cualquiera de las reivindicacione.

5. 9 y / o opcionalmente contando con N-glicanos, o N-glicanos modificados específicos de la planta.

14. Una composición que comprende una dosis eficaz de la VLP de una cualquiera de las reivindicacione.

12. 13 para inducir una respuesta inmune, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Una vacuna que comprende una dosis eficaz de la VLP de una cualquiera de las reivindicacione.

12. 13 para inducir una respuesta inmune.

16. La partícula similar a virus de cualquiera de las reivindicacione.

12. 13, la composición de la reivindicación 14 o la vacuna de la reivindicación 15 para su uso en la inducción de inmunidad a una infección por virus de la influenza en un sujeto.

Fig. 1B Fig. 2A Fig. 2B

Fig 5

HA0 de H1 (SEQ ID NO: 28)

Fig. 8A

Secuencia del péptido HA1 (SEQ ID NO: 9)

Fig. 8B

Secuencia del péptido HA5 (SEQ ID NO: 10)

FIG. 9

Subtipo H7 (SEQ ID NO: 11)

>BHB 940420 | gb: AF071776 | Símbolo : HA |Nombre : hemaglutinina precursor | Organismo: Virus A/pollo/Nueva York/1995 de la influenza A Cromosoma : 4 | Subtipo : H7 | Huésped : Ave

Fig. 10A

>gi|408516|gb|L11132.1|FLADE88HA gen de la hemaglutinina (HA) del virus de la influenza A (A/gaviota arenquera/DE/677/88 (H2N8) ) , cds completa

Fig. 10B

>BHB2107299|GB: EF473574 | Símbolo: HA | Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Texas/32/2003 de la Influenza A| Segmento: 4| Subtipo: H3| Huésped: Humano

Fig. 10C

>BHB1050162| gb: DQ021859| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Ã?nade real/MN/33/00 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H4 |Huésped: Ave

Fig. 10D

>BHB 950029 |gb: AF501235| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/pato/Shangai/1/2000 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H5 |Huésped: Ave

Fig. 10E

>BHB 1049778 |gb: DQ021667| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/Ã?nade rabudo/TX/828189/02 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H6 |Huésped: Ave

Fig. 10F

>gi | 221317 |dbj | D90304.1 | FLAHAH8N4 Virus (A/Turquia/Ontario/6118/68 (H8N4) de la influenza A) ) gen para el precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10G

>BHB 954830 |gb: AM087218| Símbolo: HA| Nombre: hemaglutinina| Organismo: Virus A/pato cuchara/Iran/G54/03 de la influenza A |Segmento: 4 |Subtipo: H9 |Huésped: Ave

Fig. 10H

>gi | 324365 | gb | M21647.1| FLAMS84HA Virus (A/pollo/Alemania/N/1949 (H10N7) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10I

>gi | 221307 | dbj | D90306.1| FLAHAHA11N Virus (A/pato/Inglaterra/56 (H11N6) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10J

>gi | 221309 | dbj | D90307.1| FLAHAHA12N Virus (A/pato/Alberta/60/76 (H12N5) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10K

>gi | 221311| dbj | D90308.1| FLAHAHA13N Virus (A/gaviota/Mer y land/704/77 (H13N6) de la influenza A) gen precursor de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10L

>gi | 324045| gb | M35997.1| FLAHA1424 A/ánade real/Gurjev/263/82 de la influenza A gen de hemaglutinina subtipo H14

Fig. 10M

>gi | 126068| gb | L43916.1| FLAHEMAC A/pato/Australia/341/83 de la influenza A mARN de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10N

>gi | 56425020| gb | AY684891.1|Virus (A/gaviota de cabeza negra/Suecia/5/99 (H16N3) de la influenza A) gen (HA) de hemaglutinina, cds completo

Fig. 10O

Influenza B (SEQ ID NO: 26)

>gi | 325175| gb | K00423.1|FLBHAZO Influenza B/Lee/40, hemaglutinina (seg 4) , segmento completo

Fig. 10P

Influenza C (SEQ ID NO: 27)

>gi | 325317| gb | M17B68.1|FLCHAJO Influenza C/Johannesburgo/66 (H16N3) ARN de hemaglutinina esterasa (seg 4) , cds completo

1-H5 comercial (A/Vietnam/1203/2004) (750 ng) 2-Extracto de proteína de hoja de imitación (37, 5 μg) 3-Extracto de proteína de hoja de una planta infiltrada con R660 (37, 5 μg)

Fig. 65

Consenso de la SEQ ID NO: 49, 48, 33 Y 9

SEQ ID NO: 74

Figura 68 Figura 69 Figura 70 Figura 71 Figura 72 Figura 73 Figura 74 Figura 75 Figura 76 Figura 77 Figura 78 Figura 79 Figura 80 Figura 81 Figura 82 Figura 83 Figura 84 Figura 85A Figura 85B Figura 86

Fig. 93

Secuencia promotora 2x35S (SEQ ID NO: 129)

Fig. 94

Casete de expresión intermedia número 972 desde Pacl (promotor secuencia arriba) hasta Ascl (inmediatamente secuencia bajo del terminador NOS) . La secuencia del promotor 2X35S está subrayada. ATG mutado está entre una caja. El sitio de restricción Apal (inmediatamente secuencia debajo de ATG para la secuencia que codifica la proteína que va a ser expresada, en este caso HA0 de H5 de A/Indonesia) , está sombreado. (SEQ ID NO: 134)

Fig. 95

Secuencia de H1 nativa de A/California/4/2009. El péptido señal de H1 nativa de A/California/4/2009 está subrayado. Los sitios de restricción Sacl y Stul están entre cajones. (SEQ ID NO: 135)

Fig. 96

Secuencia final que va a ser sintetizada que contiene la secuencia de H1 de A/California/4/2009. La porción de la proteína M desde el sitio de restricción Dralll hasta Apal está subrayada. PDISP está en negrita. Los sitios de restricción Sacl y Stul mutados están entre cajones. (SEQ ID NO: 136)

Fig. 97

Fragmento 1 sintetizado (SEQ ID NO: 137)

Fragmento 2 sintetizado (SEQ ID NO: 138)

Fragmento 3 sintetizado (SEQ ID NO: 139)

Fig. 98

Casete de expresión número 560, desde Pacl (promotor secuencia arriba) hasta Ascl (inmediatamente secuencia abajo del terminador NOS) . La secuencia de PDISP-HA0 H1 de A (California/4/2009 está subrayada. (SEQ ID NO: 146)