Partículas poliméricas sensibles a la temperatura en aplicaciones de separación de proteínas.

Un método para aislar proteínas de una disolución que contiene las proteínas,

método que incluye:

a. poner en contacto la disolución que contiene las proteínas con partículas poliméricas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye una proporción de grupos químicos ionizables y dicho contacto ocurre a una temperatura entre 30ºC y 80ºC para facilitar la retención de las proteínas por las partículas poliméricas reticuladas;

b. reemplazar la disolución que contiene la proteína por una disolución de aclarado;

c. reemplazar la disolución de aclarado por una disolución de liberación eficaz para liberar las proteínas de las partículas poliméricas reticuladas en la disolución;

d. aislar la disolución de liberación que contiene la proteína.

Partículas poliméricas sensibles a la temperatura en aplicaciones de separación de proteínas Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para aislar proteínas de una disolución que contiene las proteínas. La invención también se refiere a un método para la separación cromatográfica de proteínas. Además, la presente Invención también se refiere a partículas poliméricas hidroxllicas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, y a métodos para preparar tales partículas.

Antecedentes de la invención

La cromatografía es una técnica empleada para separar mezclas de moléculas. Implica disolver la mezcla en un disolvente o combinación de disolventes (la llamada fase móvil) para formar una disolución y posteriormente hacer pasar la disolución sobre un sólido (la llamada fase estacionarla). La combinación correcta de fase móvil y fase estacionarla hace que las moléculas sean separadas permitiendo la Interacción preferencial o selectiva de cada molécula con la fase estacionarla hasta un grado diferente. Esta diferente interacción permite que las moléculas sean separadas y por tanto aisladas, analizadas o identificadas. Tanto la fase móvil como la fase estacionaria de la cromatografía son variadas para ser adecuadas a (i) el tipo de moléculas que son separadas, (ii) la escala de la separación (p.ej., analítica, preparativa o industrial), y (¡II) la funcionalidad deseada de las moléculas separadas (p.ej. bloactlvldad). Los ejemplos de fases móviles Incluyen acetonltrllo, agua, disolución salina acuosa, metanol o mezclas de los mismos, mientras que las fases estacionarlas comunes incluyen resinas de intercambio iónico, de interacción hidrófoba o de interacción por afinidad. La cromatografía se emplea extensamente en la industria farmacéutica y alimentaria para fines analíticos, y también para aislar moléculas valiosas a escala preparativa y comercial.

Los polímeros "sagaces" o "inteligentes" son materiales que sufren cambios reversibles, rápidos, en su estructura y función respuesta a estímulos físicos, químicos o eléctricos externos. La temperatura es el estimulo más ampliamente estudiado en los sistemas de "polímeros inteligentes", y la poli(N-isopropilacrilamida) (PoliNIPAAm) es un polímero sensible a la temperatura común y extensamente estudiado.

Los materiales sensibles a la temperatura tienen potencial en cromatografía de intercambio iónico como herramienta versátil de separación, donde la elución de biomoléculas diana enlazadas puede ser Inducida mediante un cambio físico suave, tal como un ajuste en temperatura. Estos sistemas cromatográficos de polímeros inteligentes son prometedores en el aislamiento rentable de componentes valiosos, particularmente de alimentaciones complejas agrícolas-alimentarias, farmacéuticas, químicas, acuosas y otras, de una manera respetuosa con el medio ambiente.

El PoliNIPAAm y polímeros relacionados han sido usados en el campo de las separaciones para generar fases estacionarias sensibles a la temperatura para cromatografía iónica (Kobayashi et al., Analytical Chemistry, 23, 75 (13), 3244-3249; Sakamoto et al., Journal of Chromatography A, 24, 13, 247-253; Ayano et al., Journal of Separation Science, 26, 29, 738-749), exclusión de tamaños (Hosoya et al., Macromolecules, 1994, 27, 3973- 3976; Adrados et al., Journal of Chromatography A, 21, 93 (1-2), 73-78), interacción hidrófoba (Kanazawa, et al., Analytical Chemistry, 2, 72, 5961-5966), y separaciones por cromatografía basadas en afinidad (Hoffman y Stayton, Macromolecular Symposia, 24, 27, 139-151) usando un intervalo de diferentes materiales de soporte.

Además, un copolímero sensible al pH y a la temperatura de poli(N-isopropilacrilamida-co-ác¡do acrílico-co-terc- butilacrilamida) injertado sobre perlas de sílice ha sido evaluado como medio cromatográfico aniónico sensible a la temperatura (Kobayashi et al., Journal of Chromatography A, 22, 958, 19-119); Kobayashi et al., Analytical Chemistry, 23, 75 (13), 3244-3249). La separación efectiva de péptldos bioactivos básicos bajo condiciones exclusivamente acuosas se logró usando superficies modificadas con polímeros aniónicos sensibles a la temperatura/pH. De manera similar, perlas de sílice injertadas con pol¡(N-isopropilacr¡lamida-co-metilacrilato de butilo-co-N.N-dimetilaminopropilacrilamida) han sido evaluadas como medio cromatográfico catiónico sensible a la temperatura (Sakamoto et al., Journal of Chromatography A, 24, 13, 247-253; Ayano et al., Journal of Chromatography A, 26, 1119, 58-65). El medio fue diseñado para la separación eficaz de compuestos bioactivos y compuestos farmacéuticos usando fases móviles acuosas ¡socráticas.

Hay varios informes que muestran el uso de polímeros inteligentes injertados sobre perlas de sílice para cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, las industrias alimentarias y otras tienden a evitar las matrices con base de sílice debido al coste, la inestabilidad al alto pH y la falta de robustez operacional bajo las condiciones usadas a menudo en las industrias alimentarias y otras para limpiar el equipo. Además, los sorbentes basados en sílice son generalmente aplicables a separaciones analíticas, y carecen de la flexibilidad requerida para aplicaciones de proceso en las industrias alimentarias y otras.

Además, las investigaciones previas sobre el potencial de los polímeros inteligentes en la cromatografía de intercambio catiónico con perlas de sílice modificadas sólo han sido emprendidas usando compuestos pequeños, como aminoácidos y esteroides. Ha habido poca bibliografía publicada que examine la retención y liberación de proteínas grandes de significación para las industrias alimentarias, farmacéuticas, químicas o del agua (p.ej., lactoferrina) usando resinas cromatográficas de intercambio iónico sensibles a la temperatura.

Hay una necesidad de resinas poliméricas de intercambio iónico inteligentes sobre matrices no silíceas. Específicamente, hay una necesidad de medios poliméricos de intercambio iónico inteligentes basados en una matriz que sea compatible con los sistemas empleados actualmente por las industrias alimentarias, farmacéuticas y otras (tales como agarosa reticulada). Además, hay una necesidad de resinas cromatográficas de intercambio catiónico basadas en agarosa térmicamente sensibles para su aplicación en el aislamiento de proteínas grandes de importancia comercial dentro de las industrias alimentarias y otras (tales como lactoferrina).

La discusión de los antecedentes de la invención de la presente memoria se incluye para explicar el contexto de la invención. Esta no es para ser interpretada como una admisión de que cualquier material al que se hace referencia fue publicado, conocido o fue parte del conocimiento general común en cuanto a la fecha de prioridad de cualquiera de las reivindicaciones.

En toda la descripción y reivindicaciones de la memoria descriptiva, la palabra "comprenden" y las variaciones de la palabra, tales como "que comprenden" y "comprende", no pretende excluir otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona un método para aislar proteínas de una disolución que contiene las proteínas, método que incluye:

(a) poner en contacto la disolución que contiene las proteínas con partículas poliméricas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye una proporción de grupos químicos ionizables y dicho contacto ocurre a una temperatura entre 3°C y 8°C para facilitar la retención de las proteínas por las partículas poliméricas reticuladas;

(b) reemplazar la disolución que contiene la protelna por una disolución de aclarado;

(c) reemplazar la disolución de aclarado por una disolución de liberación eficaz para liberar las proteínas de las partículas poliméricas reticuladas en la disolución;

(d) aislar la disolución de liberación que contiene la proteína.

Vista desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye una proporción de grupos químicos ionizables.

Vista desde un aspecto adicional, la presente invención proporciona partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura

incluye:

(a) unidades monomérlcas que proporcionan propiedades de sensibilidad a la temperatura al copolímero;... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar proteínas de una disolución que contiene las proteínas, método que incluye:

a. poner en contacto la disolución que contiene las proteínas con partículas poliméricas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye una proporción de grupos químicos ionizables y dicho contacto ocurre a una temperatura entre 3°C y 8°C para facilitar la retención de las proteínas por las partículas poliméricas reticuladas;

b. reemplazar la disolución que contiene la proteína por una disolución de aclarado;

c. reemplazar la disolución de aclarado por una disolución de liberación eficaz para liberar las proteínas de las partículas poliméricas reticuladas en la disolución;

d. aislar la disolución de liberación que contiene la proteína.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde la temperatura de la disolución de liberación es más baja que la temperatura a la que la disolución que contiene las proteínas se puso en contacto con las partículas poliméricas reticuladas, preferiblemente a una temperatura entre °C y 3°C y más preferiblemente entre °C y 2°C.

3. Un método según la reivindicación 1 o 2, en donde la disolución de proteínas y la disolución de aclarado están a una temperatura entre 3°C y 6°C, preferiblemente entre 4°C y 6°C.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la disolución de liberación contiene un soluto iónico, preferiblemente un haluro de metal alcalino o un haluro de metal alcalinotérreo, lo más preferiblemente cloruro de sodio.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye:

a. unidades monoméricas que proporcionan propiedades de sensibilidad a la temperatura al copolímero seleccionadas del grupo que consiste en unidades N-isopropilacrilamida, unidades éter vinilmetílico o unidades N- vinilcaprolactama; y

b. unidades monoméricas que proporcionan grupos químicos ionizables al copolímero seleccionadas del grupo que consiste en unidades ácido acrílico, unidades ácido metacrílico, unidades ácido etacrílico, unidades 2- acrilamido-2-metilpropanosulfonato de sodio, unidades 3-acrilamido-3-metilbutanoato de sodio, unidades cloruro de (3-acrilamidopropil)trimetilamonio, unidades N,N-dimetilaminopropilacrilamida, unidades metacrilato de N,N- dimetilaminoetilo, unidades acrilato de N,N-dimetilaminoetilo, y unidades cloruro de 4-vinilbenciltrimetilamonio, preferiblemente unidades ácido acrílico.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye además al menos una unidad monomérica bifuncional seleccionada del grupo que consiste en unidades dimetacrilato de etilenglicol, unidades dimetacrilato de 1,4-butanodiol, unidades dimetacrilato de 1,6-hexanodiol, unidades diacrilato de etilenglicol, unidades diacrilato de 1,4-butanodiol, unidades diacrilato de 1,6-hexanodiol, y unidades N,N-metilenbisacrilamida.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye además al menos una unidad monomérica adicional seleccionada del grupo que consiste en unidades acrilato de metilo, unidades acrilato de etilo, unidades acrilato de propilo, unidades acrilato de butilo, unidades metacrilato de metilo, unidades metacrilato de etilo, unidades metacrilato de propilo, unidades N- isopropilmetacrilamida, unidades metacrilato de butilo, unidades N-terc-butilacrilamida, unidades N,N- dimetilacrilamida, unidades N,N-dietilacrilamida, y unidades N-fenilacrilamida, preferiblemente unidades N-terc- butilacrilamida, y el copolímero sensible a la temperatura comprende o bien:

a. unidades N-isopropilacrilamida, unidades terc-butilacrilamida y unidades ácido acrílico en una relación de 84:8:8 a 96:2:2, o bien

b. unidades N-isopropilacrilamida, unidades N-fenilacrilamida y unidades ácido acrílico en una relación de 84:8:8 a 96:2:2.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las partículas poliméricas reticuladas se seleccionan del grupo que consiste en partículas de agarosa reticuladas, partículas de celulosa reticuladas, partículas poliméricas vinílicas reticuladas hidrófilas y partículas de resinas poliméricas basadas en metacrilato.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las etapas (a)-(c) ocurren en una columna cromatográfica que tiene una entrada y una salida, en donde las partículas poliméricas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura se incluyen en el camino entre la entrada y la salida y la disolución que contiene las proteínas, la disolución de aclarado y la disolución de liberación se introducen

secuencialmente a través de la entrada y se recogen por la salida.

1. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en lactoferrina, lactoperoxidasa, papa (na y citocromo C.

11. Partículas pollméricas hldroxílicas reticuladas funcionallzadas con un copolímero sensible a la temperatura, en donde el copolímero sensible a la temperatura Incluye:

a. unidades monoméricas que proporcionan propiedades de sensibilidad a la temperatura al copolímero; y

b. unidades monoméricas que proporcionan grupos químicos ¡onlzables al copolímero.

12. Partículas pollméricas hldroxílicas reticuladas según la reivindicación 11, en donde las unidades monoméricas que proporcionan propiedades de sensibilidad a la temperatura al copolímero se seleccionan del grupo que consiste en unidades N-Isopropilacrllamlda, unidades éter vinilmetílico o unidades N-vinilcaprolactama, y las unidades monoméricas que proporcionan grupos químicos ¡onlzables se seleccionan del grupo que consiste en unidades ácido acrílico, unidades ácido metacrílico, unidades ácido etacríllco, unidades 2-acrilamido-2-metilpropanosulfonato de sodio, unidades 3-acrilamido-3-metilbutanoato de sodio, unidades cloruro de (3-acrilamidopropil)trimetilamonio, unidades N,N-dimetilaminopropilacrilamida, unidades metacrilato de N,N-dimetilaminoetilo, unidades acrilato de N,N- dimetilaminoetilo, y unidades cloruro de 4-vinilbenciltrimetilamonio, preferiblemente unidades ácido acrílico.

13. Partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas según la reivindicación 11 o 12, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye además al menos una unidad monomérica bifuncional seleccionada del grupo que consiste en unidades dimetacrilato de etilenglicol, unidades dimetacrilato de 1,4-butanodiol, unidades dimetacrilato de 1,6- hexanodiol, unidades diacrilato de etilenglicol, unidades diacrilato de 1,4-butanodiol, unidades diacrilato de 1,6- hexanodiol, y unidades N,N-metilenbisacrilamida, preferiblemente unidades N,N-metilenbisacrilamida.

14. Partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el copolímero sensible a la temperatura incluye además al menos una unidad monomérica adicional seleccionada del grupo que consiste en unidades acrilato de metilo, unidades acrilato de etilo, unidades acrilato de propilo, unidades acrilato de butilo, unidades metacrilato de metilo, unidades metacrilato de etilo, unidades metacrilato de propilo, unidades N-isopropilmetacrilamida, unidades metacrilato de butilo, unidades N-terc-butilacrilamida, unidades N,N- dimetilacrilamida, unidades N,N-dietilacrilamida, y unidades N-fenilacrilamida, preferiblemente unidades N-terc- butilacrilamida, y preferiblemente el copolímero sensible a la temperatura incluye o bien:

a. unidades N-isopropilacrilamida, unidades terc-butilacrilamida y unidades ácido acrílico en una relación de 84:8:8

a 96:2:2, o bien

b. unidades N-isopropilacrilamida, unidades N-fenilacrilamida y unidades ácido acrílico en una relación de 84:8:8 a

96:2:2.

15. Partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el polímero hidroxílico reticulado se selecciona del grupo que consiste en agarosa reticulada, celulosa reticulada, polímero vinílico reticulado hidroxi-funcional, polímero acrílico reticulado hidroxi-funcional, y polímero metacrílico reticulado hidroxi-funcional.

16. Un método para preparar partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, método que incluye:

a. proporcionar partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas;

b. modificar químicamente las partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas para proporcionar partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas que tienen grupos funcionales capaces de iniciar polimerización, incluyendo preferiblemente las etapas de:

i. Funcionalizar las partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas con al menos un grupo epóxido;

ii. Hacer reaccionar el grupo epóxido con amoniaco para proporcionar partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas funcionalizadas con grupos amino; y

iii. Hacer reaccionar los grupos amino con un iniciador de polimerización que tiene al menos un grupo ácido carboxílico, preferiblemente 4,4-azobis(ácido 4-cianovalérico);

c. poner en contacto las partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas que tienen grupos funcionales capaces de iniciar polimerización con una disolución de monómero que incluye al menos un monómero capaz de proporcionar propiedades de sensibilidad a la temperatura al copolímero y al menos un monómero capaz de proporcionar grupos químicos ionizables al copolímero, en donde dicho contacto inicia la polimerización de los monómeros; y

d. aislar partículas poliméricas hidroxílicas reticuladas funcionalizadas con un copolímero sensible a la temperatura

que tiene una proporción de grupos químicos ionizables.