Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de la expresión génica asociada al pronóstico de trastornos proliferativos celulares.

Método para proporcionar un pronóstico de un sujeto con cáncer de próstata,

que comprende las etapas siguientes:

a) en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto,

b) determinar el estado de metilación del gen PITX2 en dicha muestra, y

c) determinar a partir del mismo el pronóstico de dicho sujeto, en el que opcionalmente por lo menos una variable pronóstica adicional se incluye en la valoración al determinar dicho pronóstico, y en el que la hipermetilación es indicativa de un pronóstico negativo, y

d) opcionalmente, determinar un tratamiento adecuado para dicho sujeto.

Métodos y ácidos nucleicos para el análisis de la expresión génica asociada al pronóstico de trastornos proliferativos celulares.

Campo de la invención La presente invención se refiere a secuencias de ADN humano que muestran patrones de expresión heterogéneos en pacientes de cáncer. Algunas formas de realización particulares de la invención proporcionan métodos para determinar el pronóstico de dichos pacientes.

Técnica anterior

La invención a continuación se refiere a la utilización del gen PITX2 como marcador pronóstico en el tratamiento del cáncer. El gen PITX2 (NM_000325) codifica el factor de transcripción 2 del homeodominio "paired like", del cual se conoce que se expresa durante el desarrollo de estructuras anteriores, tales como los ojos, los dientes y la pituitaria anterior. En el estado de la técnica es conocido que la hipermetilación y, por consiguiente, la infraexpresión de este gen, se asocian al desarrollo de cáncer. Toyota et al. (Blood 97:2823-9, 2001) han observado hipermetilación del gen PITX2 en una gran proporción de leucemias mieloides agudas. Sin embargo, dicho documento no da a conocer que el marcador también resulte relevante para determinar el pronóstico de los pacientes de cáncer. El documento nº EP 04 029 486.0 es el documento individual más similar que resulta relevante para la evaluación de la novedad. Dicho documento da a conocer que PITX2 es un indicador de pronóstico de cáncer de mama, en el documento nº EP 04 029 486.0. Dicho documento no da a conocer que dicho gen sea un marcador pronóstico que puede aplicarse en múltiples tipos de cáncer, por lo que la invención es novedosa.

Además, basándose en dicho documento, el experto en la materia no esperaría que dicho gen también fuese un indicador pronóstico en otras enfermedades cancerosas. Debido a la heterogeneidad de los cánceres, actualmente no existe ningún indicador pronóstico molecular único que resulte aplicable a todas las clases de cáncer. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la utilización del gen PITX2 como indicador pronóstico en una pluralidad de tipos de cáncer es un efecto inesperado.

El documento nº WO 2004/035803 da a conocer que PITX2 podría utilizarse para predecir la sensibilidad de un sujeto con un trastorno proliferativo celular de la mama frente a una terapia.

El documento nº WO 01/19845 da a conocer que PITX2 se encuentra metilado en la leucemia y el cáncer de mama y de próstata.

Sumario de la invención La presente invención proporciona nuevos y eficientes métodos y ácidos nucleicos para proporcionar un pronóstico de los trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer, aunque no cáncer de mama. Resulta particularmente preferente que dichos cánceres se seleccionan de entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal (de células renales) , leucemia, cáncer de pulmón (incluyendo bronquios) , melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer de tiroides.

La invención resuelven esta vieja necesidad de la técnica al proporcionar el gen PITX2 (SEC ID nº 1) como marcador de pronóstico de cáncer. En una forma de realización particularmente preferente de la invención, el estado de metilación de la posiciones CpG del gen PITX2 y/o regiones reguladoras del mismo son indicativas del pronóstico de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer (aunque no cáncer de mama) o características de los mismos. Resulta particularmente preferente que dichos cánceres se seleccionan de entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal (de células renales) , leucemia, cáncer de pulmón (incluyendo de bronquios) , melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer de tiroides.

Para posibilitar este análisis, la invención proporciona un método para el análisis de muestras biológicas para la metilación genómica asociada al desarrollo de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer, aunque no cáncer de mama. Resulta particularmente preferente que dichos cánceres se seleccionan de entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal (de células renales) , leucemia, cáncer de pulmón (incluyendo de bronquios) , melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer de tiroides. Dicho método se caracteriza porque por lo menos un ácido nucleico, o un fragmento del mismo del gen PITX2 y/o regiones reguladoras del mismo (SEC ID nº 1) se pongan en contacto con un reactivo o serie de reactivos capaz de distinguir entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de la secuencia genómica del mismo.

Resulta particularmente preferente que el método y los ácidos nucleicos según la invención se utilicen para como

mínimo uno de entre: el pronóstico, el tratamiento, el seguimiento y el tratamiento conjuntamente con el seguimiento de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente de cáncer aunque no cáncer de mama. Resulta particularmente preferente que dichos cánceres se seleccionan de entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal (de células renales) , leucemia, cáncer de pulmón (incluyendo de bronquios) , melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer de tiroides.

La presente invención proporciona un método para determinar parámetros genéticos y/o epigenéticos del ADN genómico. El método presenta utilidad para la clasificación pronóstica mejorada de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer, aunque no cáncer de mama; más concretamente al permitir una identificación y diferenciación mejoradas de las formas agresivas y no agresivas de dicho trastorno. Resulta particularmente preferente que dichos cánceres se seleccionan de entre el grupo que consiste en cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer renal (de células renales) , leucemia, cáncer de pulmón (incluyendo de bronquios) , melanoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel y cáncer de tiroides.

La invención presenta varias mejoras sustanciales respecto al estado de la técnica. Aunque se conocen algunos ensayos de metilación para la detección de cáncer, actualmente no existe ningún sistema de clasificación molecular para la clasificación pronóstica de tumores.

La origen del ADN puede ser cualquier origen adecuado. Preferentemente el origen de la muestra de ADN se selecciona de entre el grupo que consiste en células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, sangre, esputo, heces, tejidos, por ejemplo, aunque sin limitación, los procedentes de colon, próstata, pulmón o hígado, y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el origen son biopsias, fluidos corporales, eyaculado, orina o sangre.

Concretamente, la presente invención proporciona un método para proporcionar un pronóstico de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer, aunque no cáncer de mama, que comprende: obtener una muestra biológico que comprende uno o más ácidos nucleicos genómicos, poner en contacto el ácido o ácidos nucleicos o un fragmento de los mismos con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficiente para distinguir entre secuencias de dinucleótido CpG metiladas y no metiladas dentro de una secuencia diana del ácido nucleico sujeto, en el que la secuencia diana comprende o se hibrida bajo condiciones restrictivas con una secuencia que comprende por lo menos 16 nucleótidos contiguos de SEC ID nº 1, comprendiendo dichos nucleótidos contiguos por lo menos una secuencia dinucleotídica CpG, y determinar, basándose por lo menos en parte en dicha distinción, el estado de metilación de por lo menos una secuencia dinucleotídica CpG diana, o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias dinucleotídicas CpG diana. Preferentemente, la distinción entre secuencias dinucleotídicas CpG metiladas y no metiladas dentro de la secuencia diana comprende la conversión o no conversión dependiente del estado de metilación de por lo menos una de dichas secuencias dinucleotídicas CpG en la secuencia dinucleotídica convertida o no convertida correspondiente dentro de una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 2 a SEC ID nº 5, y regiones contiguas de las mismas correspondientes... [Seguir leyendo]

1. Método para proporcionar un pronóstico de un sujeto con cáncer de próstata, que comprende las etapas siguientes:

a) en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto,

b) determinar el estado de metilación del gen PITX2 en dicha muestra, y

c) determinar a partir del mismo el pronóstico de dicho sujeto, en el que opcionalmente por lo menos una variable pronóstica adicional se incluye en la valoración al determinar dicho pronóstico, y en el que la hipermetilación es indicativa de un pronóstico negativo, y

d) opcionalmente, determinar un tratamiento adecuado para dicho sujeto.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho pronóstico se determina en términos de por lo menos uno de entre el grupo que consiste en supervivencia global del paciente, supervivencia sin enfermedad o sin recaída, complicaciones relacionadas con el tumor y tasa de progresión tumoral.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha muestra se selecciona de entre el grupo que consiste en células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, sangre, esputo, heces, tejidos, por ejemplo, aunque sin limitación, los procedentes de colon, próstata, pulmón o hígado, y combinaciones de los mismos.

4. Método según las reivindicaciones 1 a 3, que comprende poner en contacto ADN genómico aislado a partir de una muestra biológica obtenida del sujeto con por lo menos un reactivo, o una serie de reactivos que distingue entre dinucleótidos CpG metilados y no metilados en por lo menos una región diana del ADN genómico, en el que la región diana comprende, o se hibrida bajo condiciones restrictivas con una secuencia de por lo menos 16 nucleótidos contiguos del gen PITX2 y/o regiones reguladoras del mismo, en el que dichos nucleótidos contiguos comprenden por lo menos una secuencia de dinucleótido CpG, y en el que se proporciona, por lo menos parcialmente, un pronóstico de trastornos proliferativos celulares, más preferentemente cáncer, aunque no cáncer de mama.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende las etapas siguientes:

a) aislar ADN genómico a partir de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto,

b) tratar dicho ADN genómico, o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir bases citosina no metiladas en posición 5 en uracilo u otra base que es detectablemente diferente de la citosina en términos de propiedades de hibridación,

c) poner en contacto dicho ADN genómico tratado o el fragmento tratado del mismo, con un enzima de amplificación y por lo menos dos cebadores que comprenden, en cada caso, una secuencia contigua de por lo menos 18 nucleótidos de longitud que es complementaria o se hibrida bajo condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 2 a SEC ID nº 5 y complementos de las mismas, en el que el ADN tratado o un fragmento del mismo se amplifica para producir uno o más amplificados, o no se amplifica,

d) determinar, basándose en la presencia o la ausencia, o en la cantidad o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilación de por lo menos una secuencia de dinucleótido CpG del gen PITX2 o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilación promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleótido CpG del gen PITX2, y

e) determinar a partir de dicho estado de metilación según se ha determinado, el pronóstico de dicho sujeto.

6. Utilización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para proporcionar el pronóstico de un sujeto con cáncer de próstata.