Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares.

Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho cáncer.

Métodos y ácidos nucleicos para análisis de trastornos proliferativos celulares.

Campo de la invención La presente invención se refiere a secuencias de ADN genómico que muestran patrones de expresión alterados en estados morbosos respecto al estado normal. Las formas de realización particulares proporcionan métodos, ácidos nucleicos, matrices de ácidos nucleicos y kits útiles para detectar o diagnosticar trastornos proliferativos celulares.

Antecedentes Metilación de las islas CpG. Aparte de las mutaciones, la metilación aberrante de las islas CpG ha demostrado provocar un silenciamiento de la transcripción de ciertos genes que ha sido vinculado a la patogenia de diversos trastornos proliferativos celulares, incluido el cáncer. Las islas CpG son secuencias cortas ricas en dinucleótidos CpG que normalmente se suelen encontrar en la región 5' de aproximadamente el 50% de los genes humanos. La metilación de las citosinas de dichas islas provoca la pérdida de la expresión del gen y ha sido implicada en la inactivación del cromosoma X y en la impronta genómica.

Desarrollo de pruebas médicas. Dos medidas de evaluación claves de cualquier prueba de cribado o diagnóstico médico son su sensibilidad y su especificidad, las cuales miden la capacidad de la prueba para detectar con precisión a todos los individuos afectados sin excepción, y sin incluir falsamente individuos que no son portadores de la enfermedad de interés (valor predictivo) . Históricamente, muchas pruebas diagnósticas han sido criticadas por su escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado positivo verdadero (TP) se da cuando la prueba es positiva y la enfermedad está presente. Un resultado falso positivo (FP) se da cuando la prueba es positiva pero la enfermedad no está presente. Un resultado negativo verdadero (TN) se da cuando la prueba es negativa y la enfermedad no está presente. Un resultado falso negativo (FN) se da cuando la prueba es negativa pero la enfermedad no está presente. En este contexto: Sensibilidad = TP/ (TP+FN) ; Especificidad = TN/ (FP+TN) ; y Valor predictivo = TP/ (TP+FP) .

La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad de interés en el individuo que es analizado. Una prueba dotada de una mala sensibilidad produce una alta tasa de falsos negativos, es decir, individuos realmente afectados por la enfermedad que la prueba no detecta como tales. El riesgo que entraña el falso negativo es que el individuo enfermo permanezca sin diagnosticar y sin tratar durante un tiempo, periodo durante el cual la enfermedad puede avanzar hasta un estadio posterior en el que los tratamientos, si existen, pueden ser menos eficaces. Un ejemplo de una prueba dotada de una baja sensibilidad es un análisis de sangre de proteínas para detectar el VIH. Este tipo de pruebas adolece de una mala sensibilidad porque es incapaz de detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad está arraigada y el virus ha invadido el torrente sanguíneo en número sustancial. En cambio, un ejemplo de prueba dotada de una alta sensibilidad es la detección de la carga viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Esa alta sensibilidad es posible porque este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequeñas del virus. La elevada sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de pasar por alto el diagnóstico son importantes.

La especificidad, por su parte, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar con precisión a los pacientes que no están afectados por la enfermedad. Una prueba que posea una mala especificidad producirá una alta tasa de falsos positivos, es decir, individuos que son identificados como enfermos sin estarlo. Uno de los inconvenientes de los falsos positivos es que obligan a los pacientes a someterse a procedimientos o tratamientos médicos innecesarios y a afrontar los riesgos y el estrés emocional y económico que comportan, aparte de los efectos adversos que pueden tener en su salud. Una característica de las enfermedades que dificulta el desarrollo de pruebas diagnósticas dotadas de una alta especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, particularmente de los trastornos proliferativos celulares, implican a menudo una pluralidad de genes y proteínas. Además, ciertas proteínas pueden estar elevadas por razones ajenas a la enfermedad. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociados con los procedimientos diagnósticos o las intervenciones médicas ulteriores son muy altos.

El documento WO 2006/060653 divulga que los niveles de expresión de un grupo de genes que comprenden SHOX2 pueden ser utilizados para predecir la progresión de un cáncer de pulmón en un paciente que ya ha sido diagnosticado de cáncer de pulmón. No se menciona la metilación del gen SHOX2.

El documento WO 2006/008128 describe un gran número de marcadores de expresión y metilación para el cáncer de mama. Sin embargo, no menciona el SHOX2.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un método para detectar el carcinoma de pulmón, mama y vejiga en un sujeto

que comprende determinar los niveles de metilación de SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho trastorno. Varios aspectos de la presente invención proporcionan un marcador genético eficiente y único, permitiendo así el análisis de expresión de dicho marcador la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo con la tabla 2 con una sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo particularmente elevados. Se prefiere un cáncer de pulmón seleccionado del grupo constituido por: adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón macrocítico, carcinoma escamoso de pulmón y carcinoma de pulmón microcítico.

En una forma de realización la invención proporciona un método para detectar el cáncer de vejiga, mama o pulmón en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la metilación de CpG resulta indicativa de la presencia de dicho trastorno.

En una forma de realización preferida adicional dicha expresión se determina mediante la detección de la presencia o ausencia de metilación de CpG dentro de dicho gen, en el cual la infraexpresión indica la presencia trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) . Dicho método comprende las siguientes etapas: i) puesta en contacto del ADN genómico aislado de una muestra biológica (preferiblemente seleccionada entre un grupo constituido por: células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejidos incluidos en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y materia biológica derivada de broncoscopia (que incluye pero no limitada a lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial) obtenida del sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos que distinguen entre los dinucleótidos CpG metilados y sin metilar dentro de al menos una región diana del ADN genómico, donde la secuencia de nucleótidos de dicha región diana comprende por lo menos una secuencia de dinucleótido CpG de SHOX2 e ii) detectar los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente carcinoma de pulmón) , por lo menos en parte. Preferentemente la región diana comprende, o se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 1 a SEC ID nº 12, SEC ID nº 79 a SEC ID nº 83.

Preferiblemente, la sensibilidad de dicha detección oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%. Preferiblemente, la especificidad oscila aproximadamente entre el 75% y el 96%, o entre aproximadamente el 80% y el 90%, o entre aproximadamente el 80% y el 85%.

Sin embargo, en la forma de realización más preferida de la invención, la detección de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de pulmón) es posible mediante el análisis del estado de metilación de por lo menos el gen SHOX2 y/o de los elementos promotores o reguladores del mismo.

La invención proporciona un método para el análisis de muestras biológicas para características asociadas con el desarrollo de los trastornos proliferativos celulares, preferentemente aquellos de acuerdo (todavía más preferentemente el carcinoma de... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga en un sujeto que comprende determinar el nivel de metilación del gen SHOX2 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la hipermetilación resulta indicativa de la presencia de dicho cáncer.

2. Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1, que comprende poner en contacto el ADN genómico aislado de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o una serie de reactivos que distingue entre los dinucleótidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos un región diana del ADN genómico, en el que la región diana comprende, o hibrida en condiciones restrictivas con, una secuencia de al menos 16 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 5, en el que dichos nucleótidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleótido CpG.

3. Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1 o 2, que comprende:

a) extraer o si no aislar el ADN genómico de una muestra biológica obtenida de dicho sujeto;

b) tratar el ADN genómico de a) , o un fragmento del mismo, con uno o más reactivos para convertir las bases de citosina que no están metiladas en su posición 5´ en uracilo o en otra base que puede ser detectada como distinta de la citosina respecto a sus propiedades de hibridación;

c) poner en contacto el ADN genómico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificación y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleótidos que es complementaria a, o hibrida en condiciones moderadamente restrictivas o restrictivas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEC ID nº 21, 22, 45, y 46, y sus complementos, en el que el ADN genómico tratado o el fragmento del mismo o bien es amplificado para producir al menos un amplificado, o bien no es amplificado; y

d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5, o una media, o un valor que refleje un estado o nivel de metilación medio de una pluralidad de dinucleótidos CpG de la SEC ID nº 5.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica obtenida de dicho sujeto es seleccionada del grupo que comprende células o líneas celulares, cortes histológicos, biopsias, tejido incluido en parafina, líquidos corporales, eyaculado, orina, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, sangre entera, células sanguíneas aisladas, esputo y material biológico derivado de una broncoscopia (que incluye de manera no limitativa lavado bronquial, lavado broncoalveolar, cepillado bronquial, raspado bronquial y combinaciones de los mismos) .

5. Método para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según la reivindicación 1, que comprende:

a) extraer o si no aislar de otra manera el ADN genómico de una muestra biológica obtenida del sujeto;

b) digerir el ADN genómico de a) , o un fragmento del mismo, con una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación;

c) poner en contacto el digerido de enzima de restricción del ADN de b) , con una enzima de amplificación y al menos dos cebadores adecuados para la amplificación de una secuencia que comprende al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5; y

d) determinar, sobre la base de la presencia o la ausencia de un amplificado, el estado o nivel de metilación de al menos un dinucleótido CpG de la SEC ID nº 5.

6. Utilización de un ácido nucleico que comprende por lo menos 16 nucleótidos contiguos de una secuencia de ADN genómico tratado seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID nº : 21, 22, 45, 46, y sus secuencias complementarias para detectar el cáncer de pulmón, mama o vejiga según un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicho ácido nucleico comprende por lo menos 50 nucleótidos contiguos.

8. Utilización de un kit para realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el kit

(a) un reactivo bisulfito; (b) un recipiente apto para contener dicho reactivo bisulfito y la muestra biológica del paciente; (c) por lo menos un conjunto de oligonucleótidos que contiene dos oligonucleótidos cuyas secuencias en cada caso son idénticas, son complementarias, o hibridan en condiciones restrictivas o muy restrictivas con un segmento de 9 o más preferentemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de entre SEC ID nº : 21, 22, 45y 46.