Método para la obtención de partículas de fibroína regenerada empleando líquidos iónicos y ultrasonidos.

Método para la obtención de partículas de fibroína regenerada empleando líquidos iónicos y ultrasonidos.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la disolución de proteínas fibrosas insolubles, o poco solubles, en agua (concretamente fibroína) que comprende mezclar dicha proteína con un líquido iónico fundido a temperatura inferior a 100ºC y aplicar pulsos de ultrasonidos de alta potencia sobre la mezcla hasta su completa disolución. Asimismo, se contempla un procedimiento para obtener partículas de proteína (fibroína) regenerada a partir de la disolución homogénea de proteína en líquido iónico obtenido según el procedimiento anterior, que comprende el enfriamiento de la disolución hasta una temperatura comprendida entre 30 y 65ºC, la dispersión de la disolución en un disolvente precipitante mantenido en agitación, la separación de las partículas de proteína regenerada en forma sólida de la disolución del disolvente precipitante, y el lavado y secado de las partículas. Finalmente, la presente invención se refiere a las partículas de fibroína regenerada obtenidas por dicho procedimiento.

Método para la obtención de partículas de fibroína regenerada empleando líquidos iónicos y ultrasonidos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca en el sector de la Ingeniería Química y la Biotecnología para la producción de biomateriales empleados en Nanomedicina y productos para Dermocosmética. En concreto, la presente invención se refiere a un método para la obtención de partículas de proteína regenerada a partir de proteínas fibrosas insolubles o poco solubles en agua, mediante el empleo de la combinación de líquidos iónicos y ultrasonidos. Asimismo, se contemplan las partículas de proteínas regeneradas obtenidas con el método de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La presente invención se puede aplicar a las proteínas fibrosas insolubles o poco solubles en agua que forman proteínas del tipo de la fibroína de la seda, debido a la capacidad de establecer múltiples enlaces de hidrógeno Ínter e intramoleculares que estabilizan su estructura, para ser regeneradas en forma de partículas con aplicaciones industriales o biomédicas, de entre las que destacan las proteínas de la seda.

Las propiedades únicas de la fibroína de seda, como la lenta biodegradación, sus propiedades mecánicas excepcionales, en combinación con la biocompatibilidad y capacidad para incorporar fármacos, han alimentado un creciente interés en este material para una gran variedad de aplicaciones, que van desde su uso textil hasta el biomédico en nanomedicina (G. H. Altman, et al., Silk-based biomaterials, Biomater. 24 (3) (2003) 401- 416). De hecho, importantes estudios sobre la fibroína de seda han demostrado su gran aplicabilidad en biomedicina (H. L. Wamsley, etal. Selected extraskeletal effects ofsystemic treatment with basic fibroblast growth factor in ovariectomized rats, Toxico!. Pathol. 33 (5) (2005) 577-583; S. Parveen, et al., Polymeric nanoparticles for cáncer therapy, J. Drug Target. 16(2) (2008) 108-123; J. L. Nelson, et al. Ultrasonically activated chemotherapeutic drug deliveryin a ratmodel, Cáncer Res. 62 (24) (2002) 7280-7283).

La producción de partículas de biomateriales idóneos para diversas aplicaciones mediante métodos y tecnologías respetuosos con el medio ambiente sigue siendo un reto actualmente (M. A. Vandelli et al. Gelatin microspheres crosslinked with -glyceraldehyde as a potential drug delivery system: preparation, characterisation, in vitro and in vivo studies. Int J Pharm. 215 (2001)175-184; R. Arshady. Review: biodegradable microcapsular drug delivery systems: manufacturing methodology, release control and targeting prospects. J Bioact Compat Polym. 5 (1990) 315-342; A. D. George, et al. Cross-linklng of gelatin capsules and its relevance to theirin vitroein vivo performance. J. Pharm. Sci. 83 (1994) 915-921)

Históricamente se han empleado dos estrategias para producir partículas a partir de soluciones de proteínas: técnicas de ensamblado asistido por moldes o bien una precipitación inducida por variaciones en las condiciones fisicoquímicas del medio de disolución. Un ejemplo del primer método es el uso de gotas de una emulsión para definir el tamaño y la forma de las partículas (E. Donath, et al. Novel hollow polymer shells by colloid- templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37 (1998) 2201-2205; K. D. Hermanson, et al.. Engineered microcapsules fabricated from reconstituted spidersilk. Adv. Mater.19 (2007)1810-1815; X. Wang, et al. Silk microspheres for encapsulation and controlled release. J Control Release. 117 (2007) 360-370; E, Wenk, et al. Silk fibroin spheres as a platform for controlled drug delivery. J Control Release. 132 (2008) 26-34). Esta metodología permite el control del tamaño de partícula pero tiene el inconveniente de que es relativamente compleja y requiere estabilizantes de la emulsión y/o agentes entrecruzantes para mantener la rigidez de las partículas (M. A. Vandelli et al. Gelatin microspheres crosslinked with, -glyceraldehyde as a potential drug delivery system: preparation, characterisation, in vitro and in vivo studies. Int J Pharm. 215 (2001)175-184; A. S. Gobin, et al. Silk-fibroin-coated liposomes for long-term and targeted drug delivery. Int J Nanomedicine. 1 (2006) 81-87; O. P. Rubino, et al. J. Albumin microspheres as a drug delivery system: relation among turbidity ratio, degree of cross-linking, and drug release. Pharm. Res. 10 (1993) 1059-1065; A. B. MacAdam, et al. Preparation of hydrophobic and hydrophilic albumin microspheres and determination of surface carboxylic acid and amino residues. Int. J. Pharm. 151 (1997) 47-55).

Sin embargo, la estrategia de formación de partículas que hace crecer un núcleo de precipitación por adición de sucesivas moléculas de proteína mediante mezcla con un agente precipitante (disolvente en el que es insoluble la proteína; una sal precipitante; un cambio de pH; cambio de fuerza iónica, etc.) es relativamente simple y escaladle y evita los inconvenientes de la estrategia anterior (C. Weber, et al. Desolvation process and surface

characterisation of protein nanopartides. Int. J. Pharm.194 (2000) 91-102; M. C. Bríck, etal. Formation of colloidal dispersions of organic materials in aqueous media by solvent shifting. Langmuir. 19 (2003) 6367-6380; Y. Q. Zhang, et al. Formation of silk fibroin nanopartides in water-miscible organic solvent and their charaderízation. J Nanopart Res. 9 (2007) 885-900; E. Allémann, et al. Preparation of aqueous polymeric nanodispersions by a reversible salting- out process: influence of process parameters on partióle size. Int. J. Pharm. 87 (1992) 247- 253; A. Reza. Microspheres and microcapsuies, a survey of manufacturing techñiques parí II: coacervation. Polymer Eng. Sci. 30 (1990) 905-914; Reza. Microspheres and microcapsuies, a survey of manufacturing techniques: part III: solvent evaporation. Polymer Eng. Sci. 30 (1990) 915-924; D. Horn, et al. Organic nanopartides in the aqueous phase e theory, experiment, and use. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40 (23) (2001) 4330-4361; Z. Cao, et al. The preparation of regenerated silk fibroin microspheres. Soft Matter; 3 (2007) 910- 915; U. K. Slotta, et al. An engineered spider silk protein forms microspheres. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 4592-4594; A. Lammel, Processing conditions for the formation of spider silk microspheres. Chem. Sus. Chem. 1 (2008) 413-416; S. Rammensee, et al. Assembly mechanism of recombinant spider silk proteins. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 105 (2008) 6590-6595; B. Liebmann, et al. Formulation ofpoorly watersoluble substances using self-assembling spider silk protein. Colloids Surf. A. 331(2008) 126-132).

Diversas revisiones recogen los principales métodos de obtención de partículas de fibroína de seda nativa o transgénica para la liberación controlada de fármacos, (S. Andreas et al. Controlling silk fibroin partióle features fordrug delivery. Biomaterials 31 (2010) 4583-4591; E. Wenk et al. Silk fibroin as a vehicle for drug delivery applications, Journal of Controlled Release, 150, 2 (2011) 128-141) así como diversas formulaciones o presentaciones alternativas a las partículas.

La seda es segregada por las glándulas sericígenas del gusano de seda (Bombyx morí L.) como un hilo continuo y puede medir hasta 1.500 metros. Consta principalmente de dos proteínas. Una de ellas es la fibroína, que es una proteína con dos subunidades unidas por un puente disulfuro, que alterna dominios hidrofílicos y otros hidrofóbicos con tendencia a formar lámina beta estabilizada por múltiples enlaces de hidrógeno inter e intramoleculares. La otra proteína es la sericina, hidrosoluble y de estructura globular, que mantiene unidos los filamentos de fibroína. La sericina es normalmente desechada en el proceso textil, aunque tiene diversas aplicaciones en medicina y cosmética.

El punto de partida para la utilización de la seda como biomaterial, al igual que se hace para su utilización en la industria textil, es la eliminación de la sericina (aproximadamente un 25% en peso de la seda cruda). Ello se hace hirviendo la seda durante 45 minutos, en una solución jabonosa, o en carbonato sódico 0.02M, seguido de abundantes lavados con agua destilada. Tras el escurrido, se obtiene una madeja de textura similar al algodón, constituida en su totalidad por fibroína. El secado de la madeja puede durar varias horas (habitualmente toda la noche).

El procesado de la seda para la obtención de fibroína de seda regenerada (RSF) se realiza mediante un proceso de disolución de la fibra seguido de una etapa de coagulación. El proceso de regeneración consta usualmente de tres etapas, las cuales implican una etapa de disolución de la fibroína a la que ha eliminado la sericina, seguida de una etapa de diálisis para eliminar el exceso de sales y... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la disolución de fibroína caracterizado porque comprende:

a) Mezclar la fibroína con un líquido iónico fundido a temperatura inferior a 100°C, y

b) Aplicar pulsos de ultrasonidos de alta potencia sobre la mezcla obtenida en a), hasta la obtención de una disolución homogénea de fibroína en el líquido iónico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 donde el líquido iónico está compuesto por un catión orgánico, que se selecciona de entre imizadolio, piridinio, pirimidinio, pirazinio, pirazolio, oxazolio, 1,2,3,triazolio, trozolio, piperidinio, pirrolidinio, quinolinio, isoquinilio y alquilamonio, preferiblemente imidazolio y, un anión que se selecciona de entre un haluro, perborato, pseudohaluro, y carboxilatos C1-C6, preferiblemente haluro.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 donde la proporción de líquido iónico/fibroína está comprendida entre 99:1-70:30, preferiblemente 90:10.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 donde los pulsos de ultrasonido presentan una amplitud máxima comprendida entre 21|m y 494|m, elevando la temperatura de la mezcla hasta 80-150°C.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende opcionalmente:

c. Añadir agua para disminuir la viscosidad de la disolución obtenida en b).

6. Procedimiento para la obtención de partículas de fibroína regenerada caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

i. Obtención de una disolución homogénea de fibroína en liquido iónico según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5,

¡i. Enfriamiento de la disolución obtenida en i) hasta una temperatura comprendida entre 30 y 65°C, preferiblemente 45°C, m. Dispersión de la disolución obtenida en ii) en un disolvente precipitante mantenido en agitación vigorosa,

iv. Separación de las partículas de fibroína regenerada en forma sólida formadas en ¡ii) de la disolución del disolvente precipitante conteniendo el líquido iónico,

v. Lavado de las partículas de fibroína regenerada separadas en iv) con agua destilada, desionizada o ultrapura, y

vi. Secado de las partículas de fibroína regenerada lavadas en v).

7. Procedimiento según la reivindicación 6 donde las partículas de fibroína

regenerada obtenidas presentan tamaños micro y/o nanométricos.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 donde la agitación en iii) se mantiene durante un periodo comprendido entre 1-24 horas, preferiblemente 2 horas.

9. Procedimiento, según la reivindicación 6, donde la proporción en peso entre el disolvente precipitante y la solución de fibroína en líquido iónico se encuentra comprendida entre 70:30 y 95:5.

10. Procedimiento, según la reivindicación 6, donde el disolvente precipitante

empleado en iii) se selecciona de entre metanol, etanol, isopropanol, acetona, acetonitrilo, agua, DMSO, THF y combinaciones de los mismos.

11. Procedimiento, según la reivindicación 6, donde el disolvente precipitante se encuentra a una temperatura entre su punto de fusión y 4°C.

12. Procedimiento según la reivindicación 6 donde la técnica de separación

empleada en el paso iv) se selecciona de entre centrifugación, filtración y uso de membranas.

13. Procedimiento según la reivindicación 12 donde la técnica de separación

empleada es centrifugación a 12000 g.

14. Procedimiento según la reivindicación 6 donde el líquido iónico disuelto en el disolvente precipitante en iv) se recupera para su reutilización.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, donde el líquido iónico se recupera mediante destilación a vacío.

16. Procedimiento, según la reivindicación 6, donde se aplica ultrasonicación durante la etapa v) de lavado.

17. Procedimiento, según la reivindicación 6, donde el secado se lleva a cabo por liofilización a una temperatura comprendida entre -20°C y -80°C y a una presión de vacío comprendida entre 10"4 bar y 5x10"2 bar.

18. Partículas de fibroína regenerada obtenidas por el procedimiento de las reivindicaciones 6-17.