Método mejorado para cuantificar ADN en una muestra biológica.

Un método para cuantificar ADN de suceso Bt11 en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos de maíz,

comprendiendo el método:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con un primer par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 2, y una sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 3, en el que dicho primer par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de maíz del suceso Bt11, produce un primer amplicón que comprende SEC ID NO: 4, y en el que dicho primer amplicón es de diagnóstico para el suceso Bt11;

(b) poner en contacto dicha muestra biológica con un segundo par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 5 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 6, y una segunda sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 7, en el que dicho segundo par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de maíz, produce un segundo amplicón que comprende SEC ID NO: 8, y en el que dicho segundo amplicón es indicativo de la presencia del gen adhl de maíz;

(c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácidos nucleicos y un instrumento de PCR capaz de llevar a cabo una PCR en tiempo real cuantitativa;

(d) llevar a cabo la PCR en tiempo real cuantitativa usando los cebadores y sondas de (a) y (b), produciendo de ese modo el primer amplicón y el segundo amplicón;

(e) detectar simultáneamente dicho primer amplicón y dicho segundo amplicón según se producen por dicho instrumento de PCR; y

(f) calcular una cantidad relativa de dicho primer amplicón en comparación con dicho segundo amplicón, con lo que la cantidad de dicho primer amplicón es indicativa de la cantidad de ADN de Bt11 en dicha muestra biológica.

Método mejorado para cuantificar ADN en una muestra biológica ANTECEDENTES

La presente descripción se refiere a métodos mejorados para cuantificar ácidos nucleicos que son únicos para un suceso de maíz transgénico denominado Bt11 en una muestra biológica, y a composiciones útiles para llevar a cabo los métodos.

Como consecuencia de la implementación de normativas con respecto a plantas de cultivos transgénicas, por ejemplo la Normativa de la Comisión Europea (EC) 1139/98, Normativa EC 49/2, y Normativa EC 5/2, existe la necesidad de medir exactamente los niveles de ADN de una especie transgénica que puede estar presente en, por ejemplo, grano usado para alimento. Los métodos analíticos para detectar y cuantificar ADN procedente de estas plantas transgénicas han recibido gran atención, particularmente debido a que el valor umbral para el etiquetado, establecido por el European Commissions Standlng Commlttee en 1999, es 1%.

Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier método de detección de ácido nucleico bien conocido, Incluyendo, pero sin limitarse a, amplificación térmica (reacción en cadena de la polimerasa (PCR)) usando cebadores pollnucleotídicos, o hibridación de ADN usando sondas de ácidos nucleicos. Típicamente, en aras de la simplicidad y uniformidad de reactivos y metodologías para uso en la detección de un constructo de ADN particular que se ha usado para transformar diversas variedades vegetales, estos métodos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, por ejemplo promotores, terminadores y genes marcadores, debido a que, para muchos constructos de ADN, la región de la secuencia codificante es intercambiable. Como resultado, tales métodos pueden no ser útiles a la hora de discriminar entre constructos que difieren solamente con referencia a la secuencia codificante. Además, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre sucesos transgénicos diferentes, particularmente aquellos producidos usando el mismo constructo de ADN.

Para distinguir entre sucesos transgénicos, se han desarrollado métodos de PCR específicos de los sucesos. La inserción de un constructo de ADN heterólogo en un genoma de la planta crea uniones únicas específicas de los sucesos entre la secuencia de ADN integrada y la secuencia genómlca de la planta. Se han desarrollado para sucesos transgénicos métodos de PCR cuantitativa (qPCR) específicos de sucesos, Incluyendo aquel para Bt11. Los factores que pueden limitar la aplicabilidad para tales métodos pueden incluir, por ejemplo, influencias de la concentración de ADN inicial, estándares establecidos por agencias normativas, selección de cebadores y protocolo de PCR, capacidad de repetición de una muestra a otra, reproducibilidad entre diferentes laboratorios, y umbrales para bajo nivel de detección y elevada sensibilidad.

Por las razones anteriores, existe una necesidad de mejorar la detección cuantitativa de ácidos nucleicos a partir del suceso de maíz transgénico Bt11 en una muestra biológica.

SUMARIO

La presente descripción se refiere a un suceso de maíz transformado (Zea mays), denominado Bt11, que comprende dos casetes de expresión heterólogos, uno que comprende una secuencia codificante crylAb que codifica una proteína insecticida CrylAb que confiere resistencia a insectos a plantas de maíz Bt11, y el otro que comprende una secuencia codificante pat que codifica una proteína PAT que confiere resistencia a herbicidas de glufosinato-amonio a plantas de maíz Bt11. La creación del suceso Bt11 se describe en la patente U.S. n° 6.114.68. Los dos casetes de expresión se insertaron en una región 15 cM en un brazo largo del cromosoma 8, cerca de la posición 117, y en el intervalo flanqueado por dos marcadores públicos: ZIB3 y UMC15a.

La presente invención proporciona composiciones y métodos mejorados para la detección cuantitativa de ADN específico de Bt11 en muestras biológicas con respecto a un gen adh1 de maíz endógeno. Tal cuantificación de ADN de Bt11 en, por ejemplo una mezcla de grano de maíz que comprende grano de Bt11 y grano no de Bt11, se basa en un par de cebadores y en una sonda diseñada para detectar la secuencia de unión de 5 en Bt11.

En un aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para cuantificar ADN del suceso Bt11 en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos de maíz, en el que el método comprende (a) poner en contacto la muestra biológica con un primer par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 2, y una sonda marcada con un colorante un fluorescente que comprende SEC ID NO: 3, en el que el primer par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de maíz del suceso Bt11, produce un primer amplicón que comprende SEC ID NO: 4, y en el que el primer amplicón es de diagnóstico para el suceso Bt11; (b) poner en contacto la muestra biológica con un segundo par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 5 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 6, y una segunda sonda marcada con colorante fluorescente

que comprende SEC ID NO: 7, en el que el segundo par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de maíz, produce un segundo amplicón que comprende SEC ID NO: 8, y en el que el segundo amplicón es Indicativo de la presencia del gen adhl de maíz; (c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácido nucleico y un instrumento de POR capaz de llevar a cabo una POR en tiempo real cuantitativa; (d) llevar a cabo la POR en tiempo real cuantitativa usando los cebadores y sondas de (a) y (b), produciendo de ese modo el primer amplicón y el segundo amplicón; (e) detectar simultáneamente el primer amplicón y el segundo amplicón según se producen por dicho Instrumento de PCR; y (f) calcular una cantidad relativa del primer amplicón en comparación con el segundo amplicón, con lo que la cantidad del primer amplicón es indicativa de la cantidad de ADN de Bt11 en la muestra biológica.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un par de cebadores que comprenden un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 2, en el que el par de cebadores, cuando se usa en una PCR con ADN genómico procedente de maíz del suceso Bt11, produce un amplicón que comprende SEC ID NO: 4 que es de diagnóstico para el suceso Bt11.

En todavía otro aspecto, la presente descripción proporciona una sonda polinucleotídica que consiste en SEC ID NO: 3 que, cuando está marcada con un colorante fluorescente en los extremos 5 y 3, es útil en una RT-qPCR para la detección y cuantificaclón del amplicón de Bt11.

Lo anterior y otros aspectos de la descripción serán más manifiestos a partir de la siguiente descripción detallada. DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS SEC ID NO: 1 es el cebador de Bt11-5For.

SEC ID NO: 2 es el cebador de Bt11-5Rev.

SEC ID NO: 3 es la sonda de Bt11.

SEC ID NO: 4 es el amplicón de Bt11 qPCR.

SEC ID NO: 5 es el cebador de Zmadh1-F.

SEC ID NO: 6 es el cebador de Zmadh1-R.

SEC ID NO: 7 es la sonda de Zmadh1-P.

SEC ID NO: 8 es el amplicón de adhl qPCR.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las siguientes definiciones se proporcionan para definir mejor la presente descripción y guiar a aquellos de pericia normal en la técnica en la práctica de la presente descripción. Excepto que se señale de otro modo, los términos usados aquí se han de entender según el uso convencional por aquellos de pericia normal en la técnica pertinente. Las definiciones de términos comunes en biología molecular también se pueden encontrar en Rieger et al., Glossary of Genetlcs: Classlcal and Molecular, 5a edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1994. Se usa aquí la nomenclatura para bases de ADN y aminoácidos como se expone en 37 C.F.R. § 1.822.

Exactitud de un método de PCR significa la cercanía de concordancia entre un resultado de ensayo y un valor de referencia aceptado.

Eficiencia de la amplificación significa la tasa de amplificación que conduce a una pendiente teórica de -3,32 con una eficiencia de 1% en cada ciclo. La eficiencia de la reacción se puede calcular mediante la siguiente ecuación: Eficiencia = [1(-1,pendiente)]-1.

Como se usa aquí, el término amplificada significa la construcción de múltiples copias de una molécula de ácido nucleico, o múltiples copias complementarias a la molécula de ácido nucleico, usando como molde al menos una de las moléculas... [Seguir leyendo]

1. Un método para cuantificar ADN de suceso Bt11 en una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos de maíz, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto dicha muestra biológica con un primer par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 2, y una sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 3, en el que dicho primer par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico procedente de maíz del suceso Bt11, produce un primer amplicón que comprende SEC ID NO: 4, y en el que dicho primer amplicón es de diagnóstico para el suceso Bt11;

(b) poner en contacto dicha muestra biológica con un segundo par de cebadores, que comprende un primer cebador que consiste en SEC ID NO: 5 y un segundo cebador que consiste en SEC ID NO: 6, y una segunda sonda marcada con un colorante fluorescente que comprende SEC ID NO: 7, en el que dicho segundo par de cebadores, cuando se usa en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de maíz, produce un segundo amplicón que comprende SEC ID NO: 8, y en el que dicho segundo amplicón es indicativo de la presencia del gen adhl de maíz;

(c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácidos nucleicos y un instrumento de PCR capaz de llevar a cabo una PCR en tiempo real cuantitativa;

(d) llevar a cabo la PCR en tiempo real cuantitativa usando los cebadores y sondas de (a) y (b), produciendo de ese modo el primer amplicón y el segundo amplicón;

(e) detectar simultáneamente dicho primer amplicón y dicho segundo amplicón según se producen por dicho instrumento de PCR; y

(f) calcular una cantidad relativa de dicho primer amplicón en comparación con dicho segundo amplicón, con lo que la cantidad de dicho primer amplicón es indicativa de la cantidad de ADN de Bt11 en dicha muestra

biológica.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene un límite de cuantificación (LOQ) menor o igual a una concentración de ADN de Bt11 de ,8%.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene un límite de detección (LOD) menor o igual a una concentración de ADN de Bt11 de ,4%.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene un coeficiente medio de linealidad (R2) de al menos

,99.

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene una desviación estándar de reproducibilidad relativa (RSDr) de 24% o menos a una concentración de ADN de Bt11 de ,9%.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene una desviación estándar de repetitividad relativa (RSDr) de 17% o menos a una concentración de ADN de Bt11 de ,9%.

7. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método tiene un valor de exactitud de ±5% o menos a lo largo de todo el intervalo dinámico.

8. Un par de cebadores que comprende un primer par que consiste en SEC ID NO: 1 y un segundo par que consiste en SEC ID NO: 2, que funcionan juntos en presencia de un molde de ADN de suceso Bt11 de maíz en una muestra biológica para producir un amplicón diagnóstico para el suceso Bt11 de maíz.

9. Una sonda polinucleotídica que consiste en SEC ID NO: 3.