Método de medición de los efectos de los componentes en la producción de especies reactivas del oxígeno en las células.

Un método para medir la eficacia de un componente de ensayo en la reducción de componentes de especies reactivas del oxígeno (ERO) en una célula que comprende:

a. poner en contacto una célula con un material capaz de emitir fluorescencia;

b. poner en contacto la célula con el componente de ensayo;

c. poner en contacto la célula con una ERO y con un estimulante de ERO, en el que la ERO se selecciona del grupo que consiste en un compuesto que genera un ion de oxígeno, un compuesto que genera un radical libre, un peróxido, y mezclas de los mismos y caracterizado porque el estimulante de ERO se selecciona del grupo que consiste en una endotoxina, exotoxina bacteriana y mezclas de las mismas, o que comprende un lipopolisacárido; y

d. medir la fluorescencia celular.

Método de medición de los efectos de los componentes en la producción de especies reactivas del oxígeno en las células.

Antecedentes de la invención

La especies reactivas del oxígeno (ERO) son productos secundarios celulares formados por el metabolismo del oxígeno, son responsables de daños oxidativos celulares y pueden ser la causa de lesión celular, disfunción celular y muerte celular (apoptosis). Los efectos de las ERO en el metabolismo celular se han documentado bien. La acumulación de ERO en el tejido puede causar lesión oxidativa y por tanto puede ser deseable reducir las cantidades de ERO en los tejidos. Es deseable controlar la generación de ERO en células para determinar si las 1 ERO están implicadas en enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares, inflamatorias e infecciosas. Normalmente las células pueden prevenir el daño oxldatlvo de ERO con enzimas, tales como superóxido dismutasa o catalasa. Otros compuestos también son útiles en la prevención de dicho daño, incluyendo antioxidantes tales como vitaminas, ácido úrico y glutatión. Dichos compuestos, (por ejemplo, antioxidantes), pueden desempeñar una función importante en la captación de radicales libres y en la protección de organismos hospedadores frente a 15 patógenos.

Aunque se han desarrollado muchos métodos para medir las cantidades de ERO en los tejidos, hay pocos métodos que midan las concentraciones de ERO intracelulares en tiempo real. La capacidad para medir cantidades de ERO es importante, ya que las concentraciones de ERO pueden cambiar, por ejemplo, aumentar o disminuir, a lo largo del tiempo.

Por consiguiente, existe un continuo interés en desarrollar y administrar composiciones antioxidantes eficaces para prevenir los daños por ERO. Sin embargo, hay pocos métodos que sean capaces de medir los efectos de las composiciones sobre la producción de ERO en tiempo real. Por lo tanto sería deseable desarrollar métodos que pudiesen medir los efectos de los componentes en la producción de ERO intracelular.

Breve resumen de la invención

De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporciona un método que puede utilizar medir las concentraciones de ERO intracelulares en tiempo real. El método de las realizaciones puede ser útil para determinar los efectos de los componentes de ensayo sobre la producción de ERO intracelular y el estrés oxidativo en una célula. Los métodos también pueden ser útiles para determinar la capacidad de los compuestos de ensayo para reducir los componentes de ERO en una célula, en la cual la ERO puede ser endógena o exógena para la célula.

Por tanto, determinadas realizaciones descritas en el presente documento incluyen un método para medir el efecto que tiene un componente de ensayo sobre la producción de ERO en una célula. El método incluye poner en contacto una célula con un material que sea capaz de emitir fluorescencia, poner en contacto la célula con un componte de ensayo, poner el contacto la célula con una ERO y con un estimulante de ERO y medir la fluorescencia celular. Adicionalmente las realizaciones incluyen medir la fluorescencia celular después de poner en contacto la 35 célula con el material capaz de emitir fluorescencia y bien con ERO o con un estimulante de ERO, medir la fluorescencia celular después de poner en contacto la célula con un componente de ensayo, comparar los dos valores de fluorescencia y determinar si el componente de ensayo reduce la ERO.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra los valores de fluorescencia obtenidos en el Ejemplo 1; y

La FIG. 2 muestra los valores de fluorescencia de diversos componentes de ensayo, como se describe en el Ejemplo 1.

Descripción detallada de la invención

Como se usa a lo largo de esta descripción, los intervalos se usan como una abreviatura para describir cada uno y todos los valores que se encuentra en el intervalo. Puede seleccionarse cualquier valor dentro del intervalo como el 45 extremo del intervalo. Además, todas las referencias citadas en este documento se incorporan en el mismo por referencia en su totalidad. En el caso de un conflicto en una definición y de una referencia citada en la presente divulgación, la presente divulgación lo controla.

A menos que se especifique de otra manera, debe entenderse que todos los porcentajes y las cantidades que se expresan en este documento y en cualquier parte de la memoria descriptiva se refieren a porcentajes en peso. Las 5 cantidades proporcionadas están basadas en el peso del material activo.

A lo largo de esta descripción, el uso de artículos "el", "la", "un", "uno", "una" no pretenden limitar las realizaciones a una forma singular del artículo. Por ejemplo, la expresión "un componente" puede significar un solo componte o múltiples componentes. El componente en las realizaciones incluye compuestos químicos, péptidos pequeños y grandes y proteínas, ADN que expresa péptidos pequeños y grandes, proteínas y similares.

El método incluye poner en contacto una célula con un material capaz de emitir fluorescencia cuando se oxida o se reduce, poner en contacto una célula con un componente de ensayo, poner en contacto la célula con una ERO y con un estimulante de ERO, y medir la fluorescencia celular. Preferentemente, el material capaz de emitir fluorescencia es un colorante que, cuando se oxida, emite fluorescencia, más preferentemente un colorante seleccionado de dlacetato de 2,7-dlclorofluoresceína (DCF-DA), dihidrorodamina (DHR 123) y mezclas de las mismas. El método también incluye el uso de un material que, cuando se reduce, es capaz de emitir fluorescencia.

Un método preferido incluye, como compuesto de ensayo, el uso de un antioxidante. Otro método preferido incluye, como ERO, un compuesto que genera iones de oxígeno, un compuesto que genera radicales libres, un peróxido o combinaciones de los mismos. Preferentemente, la ERO es un peróxido y más preferentemente peróxido de hidrógeno. Otros métodos preferidos incluyen el uso de un estimulante de ERO, tal como un mediador inflamatorio.

El método de las realizaciones preferidas también incluye, como estimulante de ERO: (i) una endotoxina, exotoxina bacteriana, o combinaciones de las mismas; o (ii) un lipopolisacárido, lipooligosacárido o combinaciones de los mismos. Preferentemente, la ERO es un lipopolisacárido.

Una célula útil con diversos métodos de realizaciones preferidas incluye una célula inmunitaria, un linfocito, un linfoblasto, un macrófago, una célula nucleada, tal como una mitocondria, o mezclas de los mismos. La célula puede ser una célula inmortalizada, o puede estar presente en un cultivo tisular. Preferentemente, la célula tiene una pared celular que es impermeable a un colorante. Además, el colorante puede acumularse en la mitocondria celular. Se prefiere eliminar con lavado cualquier exceso de colorante presente en la célula.

En el método de las realizaciones preferidas, el compuesto de ensayo se transporta al interior de la célula, de manera activa o pasiva. Preferentemente, cualquier exceso de compuesto de ensayo se elimina de la célula mediante lavado. Del mismo modo, preferentemente la ERO y el estimulante de ERO (por ejemplo, un mediador inflamatorio) se transporta hacia el Interior de la célula, de manera activa o pasiva, y se prefiere eliminar con lavado cualquier exceso de ERO y de estimulante ERO presente en la célula.

De acuerdo con diversos aspectos de realizaciones preferidas, inicialmente una célula se pone en contacto con un material capaz de emitir fluorescencia cuando se oxida o se reduce, preferentemente un colorante. Los colorantes útiles en las realizaciones de la presente invención incluyen colorantes que emiten fluorescencia cuando se oxidan o se reducen. Preferentemente, dichos colorantes emiten fluorescencia cuando, por ejemplo, una ERO los oxida o reduce. Se prefiere el uso de colorantes que se ponen en contacto con células de una forma no fluorescente y después emiten fluorescencia cuando reaccionan con una ERO, por ejemplo, una ERO producida intracelularmente o introducida a partir de fuentes externas. Algunos colorantes útiles que poseen estos atributos son conocidos por los expertos habituales en la técnica y pueden incluir colorantes del tipo de la fluoresceína, tales como diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCF-DA). El DCF-DA es un colorante permeable a la membrana que puede difundirse a través de la membrana lipídica celular. No emite fluorescencia cuando está inactivo y forma una diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente cuando se oxida por ERO. Otros colorantes útiles en la presente invención pueden incluir derivados y análogos de fluoroesceína, tales como dihidrorodamina (DHR 123), que es un análogo... [Seguir leyendo]

1. Un método para medir la eficacia de un componente de ensayo en la reducción de componentes de especies reactivas del oxígeno (ERO) en una célula que comprende:

a. poner en contacto una célula con un material capaz de emitir fluorescencia;

b. poner en contacto la célula con el componente de ensayo;

c. poner en contacto la célula con una ERO y con un estimulante de ERO, en el que la ERO se selecciona del grupo que consiste en un compuesto que genera un ion de oxígeno, un compuesto que genera un radical libre, un peróxido, y mezclas de los mismos y caracterizado porque el estimulante de ERO se selecciona del grupo que consiste en una endotoxina, exotoxina bacteriana y mezclas de las mismas, o que comprende un lipopolisacárido; y

d. medir la fluorescencia celular.

2. El método de la reivindicación 1 en el que el material capaz de emitir fluorescencia es un colorante que emite fluorescencia cuando se oxida, en el que opcionalmente el colorante se selecciona del grupo que consiste en diacetato de 2,7-diclorofluoresceína (DCF-DA), dihidrorodamina (DHR 123) y mezclas de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1 en el que el material capaz de emitir fluorescencia es un colorante que cuando se reduce emite fluorescencia.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el componente de ensayo es un antioxidante.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la ERO es un peróxido, opcionalmente peróxido de hidrógeno.

6. El método de la reivindicación 1, en el que la célula es una célula inmunitaria

7. El método de la reivindicación 1, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en un linfocito, un

linfoblasto, un macrófago, una bacteria, un anaerobio facultativo y mezclas de los mismos.

8. El método de la reivindicación 1, en el que la célula tiene una pared que es permeable al material capaz de emitir fluorescencia.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el componente de ensayo se transporta al interior de la célula.

1. El método de la reivindicación 1, en el que el componente de ensayo se transporta de manera activa o pasiva al interior de la célula.

11. El método de la reivindicación 1, en el que la ERO se transporta al interior de la célula mediante transporte activo o pasivo.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la célula emite fluorescencia.

13. El método de la reivindicación 1, en el que el método mide el contenido de ERO de la célula.

14. Un método para medir la eficacia de un componente de ensayo en la reducción de componentes de ERO en una célula que comprende:

a. poner en contacto una célula con un material capaz de emitir fluorescencia;

b. poner en contacto la célula con un componente de ensayo;

c. medir la fluorescencia de celular;

d. poner en contacto la célula con una ERO y un estimulante de ERO, en el que la ERO se selecciona del grupo que consiste en un compuesto que genera iones de oxígeno, un compuesto que genera radicales libres, un peróxido y mezclas de los mismos y en el que el estimulante de ERO se selecciona del grupo que consiste en una endotoxina, exotoxina bacteriana y mezclas de las mismas, o que comprende un lipopolisacárido;

e. medir la fluorescencia celular; y

f. comparar la fluorescencia celular de c con la fluorescencia de e y determinar la eficacia del componente de ensayo en la reducción de ERO.