Método de criba para detectar muestras con anticuerpos de antifosfolípido.

Método de criba para identificar una muestra que contiene con alta probabilidad anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos,

en cuyo caso el método presenta los siguientes pasos:

a) mezclar una muestra de un paciente con un reactivo que contiene plaqueta para producir una mezcla de ensayo,

b) adicionar un activador de plaquetas a la mezcla de ensayo, y

c) medir la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayos,

en cuyo caso una aglomeración de plaquetas aumentada frente a la normal en la mezcla de ensayo indica la presencia de anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos en la muestra del paciente.

Método de criba para detectar muestras con anticuerpos de antifosfolípido La invención se encuentra en el campo del diagnóstico de coagulación y se refiere a un método de criba para detectar muestras que contienen anticuerpos de antifosfolípido.

El síndrome de antifosfolípido (APS, antipospholipid syndrome) es uno de los desórdenes autoinmunes más comunes y causa trombosis, abortos espontáneos y complicaciones del embarazo. El síndrome de antifosfolípido es causado por los llamados anticuerpos de antifosfolípido (APA) los cuales se enlazan a fosfolípidos aniónicos, a proteínas o a complejos proteína/fosfolípido. Los anticuerpos de antifosfolípido que forman complejos con determinadas proteínas y fosfolípidos son un grupo muy heterogéneo de autoanticuerpos que pueden dirigirse contra una multiplicidad de antígenos tales como, por ejemplo, contra la apolipoproteína β2-glicoproteína I (β2GPI) , cardiolipina, protrombina, proteína C, proteína S, annexina V, trombomodulina, factor XII y otros, así como contra complejos de estas proteínas con fosfolípidos.

Los llamados anticoagulantes de lupus son anticuerpos de antifosfolípido que por definición prolongan los tiempos de coagulación de determinados ensayos de coagulación como, por ejemplo, de aPTT. De modo paradójico, los anticoagulantes de lupus inhiben la reacción de coagulación en vitro mientras que una reacción de coagulación elevada (hipercoagulabilidad) acompaña el síndrome de antifosfolípido (APS) in vivo. Sin embargo, también existen anticuerpos de antifosfolípido que no están cubiertos por estos ensayos y que aún así tienen un efecto protrombotico.

Aún no ha sido aclarado de manera concluyente cómo los anticuerpos de antifosfolípido despliegan su efecto protrombótico in vivo. Un mecanismo de acción parece transcurrir por la activación de plaquetas sanguíneas (trombocitos) (Urbanus, R.T. et al., Platelets and the antiphospholipd syndrome. Lupus 2008 Oct; 17 (10) : 888-94) .

El diagnóstico del síndrome de antifosfolípido (APS) en el laboratorio se ve dificultado por la heterogeneidad de los anticuerpos de antifosfolípido. Para la detección directa de los anticuerpos se aplican métodos inmunológicos. Sin embargo, de esta manera también se arrastran muchos anticuerpos que no tienen efecto protrombótico in vivo. Para la detección indirecta de los anticuerpos se aplican pruebas de coagulación. Pruebas particulares que se basan en la determinación del DRVVT (Dilute Russellâ?s Viper Venom Time o tiempo de veneno de víbora diluido de Rusell) muestran una correlación relativamente buena con la eficiencia protrombótica de los anticuerpos de antifosfolípido. El diagnóstico de lupus requiere de mucho esfuerzo porque cada muestra de los pacientes tiene que someterse a varios pasos de análisis (para una visión general: Devreese, K. and Hoylaerts, M.F., Challenges in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome (Retos en el diagnóstico del síndrome de antifosfolípido) . Clin. Chem. 2010, 56 (6) : 930-940) .

Por lo tanto, sería deseable disponer de un ensayo de criba que haga posible identificar muestras que contienen con una alta probabilidad anticuerpos de antifosfolípido con efecto protrombótico. Esto tendría la ventaja de que con los métodos de detección específicos costosos solamente tendrían que analizarse aquellas muestras para las cuales se ha revelado un primer indicio de la presencia de anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos.

Por lo tanto, el objetivo fundamental de la presente invención es proporcionar un método que haga posible identificar muestras que con una alta probabilidad contienen anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos.

Este objetivo se logra mediante un método que tiene los siguientes pasos:

a) mezclar una muestra de un paciente con un reactivo que contiene plaquetas sanguíneas para dar lugar a una mezcla de ensayo, b) adicionar un activador de plaquetas sanguíneas a la mezcla de ensayo, y c) medir la aglomeración de plaquetas sanguíneas en la mezcla de ensayo.

Una aglomeración de plaquetas sanguíneas elevada en la mezcla ensayo indica la presencia de anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos en la muestra de paciente.

Se ha encontrado que en una mezcla de la muestra del paciente y reactivo que contiene plaquetas sanguíneas, los anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos que están contenidos en la muestra del paciente, aumentan la aglomeración de las plaquetas sanguíneas. En efecto, el ensayo no es específico para anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos porque otros factores que estimulan la aglomeración de plaquetas sanguíneas, como por ejemplo un nivel elevado de trombina, también pueden conducir a una aglomeración aumentada de plaquetas. No obstante,

pueden eliminarse las muestras que no aumentan la aglomeración de las plaquetas en el ensayo y no tienen que analizarse en ensayos posteriores para la determinación específica de anticuerpos de antifosfolípido.

El término "anticuerpos de antifosfolípido protrombótico" designa anticuerpos de antifosfolípido que prolongan in vitro el tiempo de coagulación de una muestra de plasma. Una prolongación del tiempo de coagulación puede determinarse, por ejemplo, con ayuda de un ensayo de coagulación con base en DRVVT. Sin embargo, la sensibilidad de tal ensayo de "anticoagulante de lupus" no es suficiente para reconocer algunos anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos. Es probable que el método de la invención presente una mejor sensibilidad porque en tal caso también se mide la acción protrombótica en vitro. En lugar de la acción inhibidora de coagulación, se mide la acción real promotora de aglomeración de plaquetas in vitro.

El término "muestra del paciente" comprende en primera línea fluidos corporales, principalmente plasma rico en plaquetas, plasma pobre en plaquetas, su bueno y sangre entera.

El término "reactivo que contiene plaquetas" comprende suspensiones que contienen plaquetas con capacidad funcional, es decir de aglomeración (trombocitos) de origen humano. Puede ser, por ejemplo, una suspensión de plaquetas aisladas en una solución de búfer. Por el término "suspensiones" también se entienden re-suspensiones de plaquetas secas por congelamiento. De modo alternativo, puede ser plasma rico en plaquetas o sangre entera de un donante o plasma combinado de varios donantes.

Por el término "activador de plaquetas" se entiende una sustancia que puede inducir la aglomeración de trombocitos. Activadores de plaquetas adecuados son, por ejemplo, ADP (adenosin-5â?-difosfato) , colágeno, epinefrina, ácido araquidónico, ristocetina y trombina. También pueden adicionarse a la mezcla de ensayo combinaciones de activadores de plaquetas, por ejemplo una acumulado de colágeno y ADP (Col/ADP) o una acumulado de colágeno y epinefrina (Col/Epi) .

La concentración preferida de epinefrina se encuentra entre 1 y 20 μmol/L en la mezcla de ensayo. La concentración preferida de ADP se encuentra entre 0, 2 y 30 μmol/L en la mezcla de ensayo, particularmente preferible entre 0, 2 y 10 μmol/L en la mezcla de ensayo.

La determinación cuantitativa de la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayo que se correlaciona con la acción estimulante de aglomeración de plaquetas de los anticuerpos de antifosfolípido contenidos en la muestra del paciente puede efectuarse mediante la medición de la intensidad de luz dispersa (nefelométricamente) o mediante la medición de la turbiedad de la mezcla ensayo (turbidimétricamente) .

De manera preferente se mide la velocidad de la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayo. La medición de la velocidad de aglomeración de plaquetas dentro del período de 12 a 50 segundos después de adicionar un activador de plaquetas a la mezcla ensayo ha demostrado ser de gran valor informativo. De modo alternativo, puede determinarse la velocidad máxima de aglomeración de plaquetas.

En otra forma de realización del método de la invención, la medición de la aglomeración de plaquetas tiene lugar en condiciones de flujo y por lo tanto en presencia de altas fuerzas de corte (cizalladura) . Un principio de ensayo de este tipo se implementa, por ejemplo, en el sistema de análisis Platelet Function Analyzer System (PFA-100®, PFA200, Siemens Healthcare Diagnostics GmbH, Marburg, Alemania) . Este método de medición es adecuado principalmente en el caso en que la muestra de paciente y/o el reactivo que contiene plaquetas consiste de sangre entera.

Para simular las condiciones de flujo y las fuerzas de corte tal como rigen en vasos sanguíneos arteriales más pequeños, en una celda de medición especial se genera una presión... [Seguir leyendo]

1. Método de criba para identificar una muestra que contiene con alta probabilidad anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos, en cuyo caso el método presenta los siguientes pasos:

a) mezclar una muestra de un paciente con un reactivo que contiene plaqueta para producir una mezcla de ensayo, b) adicionar un activador de plaquetas a la mezcla de ensayo, y c) medir la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayos, en cuyo caso una aglomeración de plaquetas aumentada frente a la normal en la mezcla de ensayo indica la presencia de anticuerpos de antifosfolípido protrombóticos en la muestra del paciente.

2. Método según la reivindicación 1, en el cual la muestra del paciente se compone de plasma rico en plaquetas, plasma pobre en plaquetas, suero o sangre entera.

3. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual el reactivo que contiene plaqueta se compone de una suspensión de plaquetas aisladas en una solución de búfer, de plasma rico en plaquetas o sangre entera.

4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual se adiciona un activador de plaquetas del grupo de ADP, colágeno, epinefrina, ácido araquidónico y trombina a la mezcla de ensayo.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en cuyo caso se mide de modo turbidimétrico la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayo.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en cuyo caso la aglomeración de plaquetas se mide de modo nefelométrico en la mezcla de ensayo.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en cuyo caso la aglomeración de plaquetas se mide en la mezcla de ensayo

i) haciendo pasar la mezcla de ensayo a través de un capilar y a continuación a través de una abertura de un elemento de separación, y ii) midiendo el tiempo que se necesita para la formación de un coágulo de trombocitos en la abertura del elemento de separación hasta la clausura de la abertura.

8. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual se mide la velocidad de la aglomeración de plaquetas en la mezcla de ensayo, preferiblemente dentro del período de tiempo de 12 a 50 segundos después de adicionar un activador de plaquetas a la mezcla de ensayo.

9. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el cual se mide la velocidad máxima de aglomeración de plaquetas.

10. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en el cual se mide la aglomeración normal de plaquetas en una segunda mezcla de ensayo, en la cual una muestra normal está mezclada con el reactivo que contiene plaquetas para dar una mezcla de ensayo y en cuyo caso se establece la proporción, medida en la mezcla de ensayo en el paso c) , de aglomeración de plaquetas a la aglomeración de plaquetas normal, y una proporción mayor a 1.0 indica la presencia de anticuerpos de antifosfolípido en la muestra de paciente.