Líneas de células MDCK que soportan el crecimiento viral hasta altos títulos y proceso de biorreactor que las usa.

Célula de riñón canino Madin-Darby (MCDK) identificada mediante el n.

º de registro de la ATCC PTA-7909 o el n.º de registro de la ATCC PTA-7910, en la que una composición de cultivo celular que comprende una pluralidad de las células MDCK soporta la replicación de un virus influenza adaptado al frío hasta un logaritmo en base 10 de la mediana de la dosis de infección en cultivo tisular por mililitro (log10 TCID50/ml) de 7,8 o mayor o hasta un logaritmo en base 10 de unidades de focos fluorescentes por mililitro (log10 FFU/ml) de 7,8 o mayor.

Líneas de células MDCK que soportan el crecimiento viral hasta altos títulos y proceso de biorreactor que las usa.

Campo de la invención La presente invención se refiere a células MDCK novedosas tal como se definen mediante las reivindicaciones que pueden usarse para hacer crecer virus, por ejemplo virus influenza, particularmente virus influenza adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura y/o atenuados, en cultivo celular hasta un alto título. Las células MDCK pueden adaptarse a o modificarse genéticamente para hacerse crecer en medio de cultivo libre de suero. La presente invención se refiere además a composiciones de cultivo celular que comprenden las células MDCK y a métodos de cultivo para hacer crecer las células MDCK. La presente invención se refiere además a métodos para producir virus influenza en cultivo celular usando las células MDCK de la invención. En particular la presente invención se refiere a procesos de biorreactor novedosos para hacer crecer células adherentes (por ejemplo, células MDCK) que pueden usarse para hacer crecer virus (por ejemplo, virus influenza, particularmente virus influenza adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura y/o atenuados) , en cultivo celular hasta un alto título. Los procesos de biorreactor pueden utilizar medio de cultivo libre de suero.

Antecedentes de la invención La vacunación es la medida de salud pública más importante para prevenir la enfermedad provocada por las epidemias anuales de gripe. El uso eficaz de las vacunas depende de poder producir rápidamente grandes cantidades de material de vacuna (por ejemplo, virus) a partir de una fuente estable y fácil de cultivar. El desarrollo rápido de las vacunas y su disponibilidad abundante es crítico en la lucha contra muchas enfermedades humanas y animales. Los retrasos en la producción de vacunas y los déficits en su cantidad pueden provocar problemas para abordar los brotes de enfermedad. Por ejemplo, estudios recientes sugieren que hay una causa de preocupación referente a los largos tiempos de entrega requeridos para producir vacunas contra gripe pandémica. Véase, por ejemplo, Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953. Por consiguiente, los esfuerzos recientes para producir vacunas se han centrado en el crecimiento de virus de virus para vacunas en cultivo celular.

Se han usado tradicionalmente células de riñón canino Madin Darby (MDCK) para la titulación de virus influenza (Zambon M., en Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster y Hay, cap. 22, págs. 291-313, Blackwell Science (1998) ) . Estas células se establecieron en 1958 a partir del riñón de un cocker spaniel macho normal. En la ATCC figura que la línea MDCK (CCL 34) se ha depositado por S. Madin y N.B. Darby. Por ejemplo, el documento US 2006/0188977 describe una línea de células MDCK no tumorigénica seleccionada del grupo que consiste en: MDCK-S (ATCC PTA-6500) ; MDCK-SF111 (ATCC PTA-6501) ; MDCK-SF102 (ATCC PTA-6502) y MDCK-SF103 (ATCC PTA-6503) . Sin embargo, las líneas de células MDCK existentes padecen varios defectos, incluyendo posible tumorigenicidad, el requisito de suero animal en cultivo celular y bajos rendimientos de virus influenza adecuados para su uso en vacunas. Por consiguiente, sigue habiendo una necesidad no satisfecha de líneas de células MDCK, preferiblemente líneas de células MDCK no tumorigénicas que puedan hacer crecer tales cepas de influenza hasta un alto título, preferiblemente, en medios libres de suero. Estas y otras necesidades no satisfechas se proporcionan por la presente invención.

Sumario de la invención La presente invención se define mediante las reivindicaciones. La presente invención proporciona células MDCK tal como se definen mediante las reivindicaciones que pueden soportar el crecimiento de virus influenza, por ejemplo, virus influenza adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura y/o atenuados, hasta un alto título. Las células MDCK pueden hacerse crecer en formulaciones de medios o bien que contienen suero o bien libres de suero incluyendo formulaciones libres de proteínas animales (APF) , pero preferiblemente crecen en formulaciones de medios libres de suero y/o APF. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona una célula de riñón canino Madin-Darby (MCDK) identificada mediante el nº de registro de la ATCC PTA-7909 o el nº de registro de la ATCC PTA7910, en la que una composición de cultivo celular que comprende una pluralidad de las células MDCK soporta la replicación de un virus influenza adaptado al frío hasta un logaritmo en base 10 de la mediana de la dosis de infección en cultivo tisular por mililitro (log10 TCID50/ml) de 7, 8 o mayor o hasta un logaritmo en base 10 de unidades de focos fluorescentes por mililitro (log10 FFU/ml) de 7, 8 o mayor. En algunas realizaciones, las células MDCK de la invención son adherentes. En otras realizaciones, las células MDCK de la invención son no adherentes (por ejemplo, pueden hacerse crecer en condiciones no adherentes) . En algunas realizaciones, las células MDCK de la invención no son tumorigénicas. Las células MDCK de la invención pueden tener una morfología epitelial. Las células MDCK de la invención pueden ser adherentes y pueden tener una morfología epitelial. Las células MDCK de la invención pueden adaptarse o seleccionarse para hacerse crecer en condiciones no adherentes. En algunas realizaciones, las células MDCK de la invención son adherentes y no son tumorigénicas.

Los virus que pueden hacerse crecer en las células MDCK de la invención incluyen pero no se limitan a virus de ARN de hebra negativa, incluyendo pero sin limitarse a influenza, VRS, virus parainfluenza 1, 2 y 3, y metapneumovirus humano, así como otros virus, incluyendo virus de ADN, retrovirus, virus de ARN de hebra positiva, virus de ARN de hebra negativa, virus de ARN bicatenarios, incluyendo, pero sin limitarse a, papovavirus, virus de la estomatitis vesicular, virus vaccinia, virus de Coxsackie, reovirus, parvovirus, adenovirus, virus de la poliomielitis, virus del sarampión, virus de la rabia y virus del herpes.

También se describen en el presente documento métodos y formulaciones de medios útiles para la derivación, la propagación y el mantenimiento de células MDCK que pueden soportar el crecimiento de virus influenza, por ejemplo, virus influenza adaptados al frío y/o sensibles a la temperatura y/o atenuados, hasta un alto título. Las células MDCK de la invención son particularmente útiles para la producción de material de vacuna tal como, por ejemplo, virus. Por consiguiente, también se describe en el presente documento una composición de cultivo celular que comprende células MDCK y un medio de cultivo celular, en el que la composición de cultivo celular soporta la replicación de un virus influenza adaptado al frío y/o sensible a la temperatura y/o atenuado hasta un log10 TCID50/ml de al menos aproximadamente 7, 0.

También se describen en el presente documento métodos de producción de material de vacuna (por ejemplo, virus) cultivando cualquier célula MDCK descrita en el presente documento en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la producción de material de vacuna y aislando el material de uno o más de la célula o el medio en el que se hace crecer. Por tanto, también se describe en el presente documento un método para producir virus influenza en cultivo celular, que comprende infectar una composición de cultivo celular descrita en el presente documento con un virus influenza, incubar la composición de cultivo celular en condiciones que permiten la replicación del virus influenza; y aislar virus influenza de la composición de cultivo celular.

También se describen en el presente documento composiciones inmunogénicas. Por ejemplo, se describen en el presente documento composiciones inmunogénicas que comprenden el material de vacuna producido tal como se describió anteriormente y, opcionalmente, un excipiente tal como un excipiente farmacéuticamente aceptable o uno o más componentes de administración farmacéuticamente aceptables.

Métodos de producción de respuestas inmunogénicas en un sujeto a través de la administración de una cantidad eficaz de una o más de las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente a un sujeto están también dentro de la presente descripción. Adicionalmente, métodos de tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección viral (por ejemplo, gripe viral) en un sujeto a través de la administración de una o más composiciones inmunogénicas descritas anteriormente en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica contra la infección viral también son parte de la presente descripción. Los sujetos para tal tratamiento pueden incluir mamíferos... [Seguir leyendo]

1. Célula de riñón canino Madin-Darby (MCDK) identificada mediante el nº de registro de la ATCC PTA-7909 o el nº de registro de la ATCC PTA-7910, en la que una composición de cultivo celular que comprende una pluralidad de las células MDCK soporta la replicación de un virus influenza adaptado al frío hasta un logaritmo en base 10 de la mediana de la dosis de infección en cultivo tisular por mililitro (log10 TCID50/ml) de 7, 8 o mayor o hasta un logaritmo en base 10 de unidades de focos fluorescentes por mililitro (log10 FFU/ml) de 7, 8 o mayor.

2. Célula MDCK según la reivindicación 1, en la que las células MDCK son adherentes, no tumorigénicas y/o no oncogénicas.

3. Célula MDCK según la reivindicación 1 ó 2, en la que el virus influenza está atenuado y es sensible a la temperatura.

4. Célula MDCK según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el virus influenza comprende uno o más segmentos génicos de la cepa de influenza A/Ann Arbor/6/60 o B/Ann Arbor/1/66.

5. Célula MDCK según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en la que la composición comprende un medio de cultivo celular libre de suero seleccionado del grupo que consiste en:

a) MediV-105, en el que MediV-105 es medio de Taub sin transferrina (es decir, una mezcla 50:50 de DMEM y F12 de Ham complementado con hormonas, insulina 5 !g/ml, prostaglandina E1 25 ng/ml, hidrocortisona 50 nM, triyodotironina 5 pM y Na2SeO3 10 nM, glucosa 4, 5 g/l, NaHCO3 2, 2 g/l y L-glutamina 4 mM) , y se complementa adicionalmente con concentrado lipídico de concentración final 1X, peptona de trigo E1 2, 5 g/l, EGF 5 !g/l, citrato de amonio férrico 0, 2 mg/l y tropolona 0, 25 mg/l;

b) MediV-105 complementado con glucosa;

c) MediV-107 (que tiene una formulación final tal como se muestra en la tabla 10) ;

d) MediV-107 complementado con glucosa;

e) M-32 (es decir, MediV-105 que tiene una concentración de glucosa de entre 4 g/l y 4, 5 g/l y que está complementado adicionalmente con oligoelementos A, B y C tal como se muestra en la tabla 9 a una concentración final de 1X) ; y

f) M-32 complementado con glucosa.

6. Método para producir un virus influenza adaptado al frío en cultivo celular, que comprende:

(a) cultivar las células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en un biorreactor de uso único (SUB) en presencia de microportadores en condiciones de cultivo que incluyen una velocidad de agitación de entre 50 y 150 rpm, produciendo de ese modo células cultivadas;

(b) infectar las células cultivadas con un virus influenza adaptado al frío, produciendo de ese modo células infectadas;

(c) incubar las células infectadas en condiciones que permiten la replicación del virus influenza; y

(d) aislar el virus influenza de las células cultivadas.

7. Método según la reivindicación 6, en el que la velocidad de agitación es de 80 rpm a 120 rpm.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la velocidad de agitación es de 90 rpm a 100 rpm.

9. Método según la reivindicación 6, 7 u 8, en el que

(i) se añaden medio nuevo o componentes adicionales del medio al cultivo celular durante la etapa (a) y/o la etapa (b) ; o

(ii) se intercambia una porción del medio antes de la etapa (a) .

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que se añade una proteasa antes de o durante la etapa (b) .

11. Método según la reivindicación 6, 7 u 8, en el que no se elimina ni se sustituye o se elimina y se sustituye algo

del medio de cultivo celular por medio nuevo antes de o durante la etapa (b) .

12. Método según la reivindicación 6, 7 u 8, en el que se añade una proteasa poco antes, simultáneamente con o

poco después de la etapa (b) , en el que la proteasa provoca la escisión de la proteína precursora de hemaglutinina 5 [HA0] y por tanto la adsorción de los virus sobre las células.

13. Método según la reivindicación 10 ó 12, en el que la proteasa es una serina proteasa.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la proteasa es tripsina. 10

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a una multiplicidad de infección (MOI) de entre 0, 00001 FFU/célula y 1 FFU/célula.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a una MOI de entre 0, 001 FFU/célula y 15 0, 003 FFU/célula.

17. Método según la reivindicación 15, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a una MOI de entre 0, 00001 FFU/célula y 0, 0003 FFU/célula.