Línea celular de amniocitos humanos permanentes para la producción de virus de la gripe.

Un procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe,

que comprende:

a) infectar un amniocito humano permanente con un virus de la gripe;

b) cultivar el amniocito humano permanente;

c) expresar el virus de la gripe; y

d) aislar el virus de la gripe del medio,

en el que el amniocito humano permanente expresa los productos génicos adenovirales E1A y E1B.

Línea celular de amniocitos humanos permanentes para la producción de virus de la gripe

La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de una vacuna de virus de la gripe usando amniocitos humanos permanentes, así como al uso de amniocitos humanos permanentes para la producción de una vacuna a base de virus de la gripe.

La vacunación es la medida más importante en la asistencia sanitaria, para prevenir enfermedades ocasionadas por la epidemia anual de gripe. El uso satisfactorio de las vacunas depende, por tanto, de que la producción lo más rápida posible de cantidades suficientemente grandes de inoculantes, tales como virus muertos de fuentes estables y fáciles de usar. El rápido desarrollo de vacunas y su adecuada disponibilidad son decisivos en la lucha contra muchas enfermedades humanas y animales. Como resultado de los retrasos en la producción de vacunas y las pérdidas cuantitativas, se pueden presentar problemas en el manejo de los brotes epidémicos de la enfermedad. Esto da como resultado que los esfuerzos más recientes se concentran en el cultivo de virus en cultivo celular para su uso como vacunas.

Hasta ahora, las vacunas antigripales disponibles se producen en huevos de gallina incubados. Se debe comprobar que estos huevos de gallina están exentos de determinadas contaminaciones virales y bacterianas. Estos huevos de gallina libres denominados exentos de patógenos específicos (SPF, por sus siglas en inglés) están disponibles de forma comercial. Aunque se ha encontrado que los huevos de gallina son muy útiles en la propagación de virus animales y humanos, tienen algunas desventajas en la producción de vacunas. Por ejemplo, en el caso de una pandemia, se producirá una alta demanda de huevos de gallina para la producción de vacunas puesto que es necesario un huevo para la producción de una vacuna convencional. Dada la limitada disponibilidad de huevos de gallina se debe contar con un lapso de aproximadamente un año para el suministro de huevos de gallina en una cantidad suficiente. Además existen subtipos de gripe que son altamente patógenos para las gallinas, de manera que en el caso de una pandemia podrían provocar escasez en el suministro de huevos de gallina. Además el proceso de producción es muy costoso y requiere mucho tiempo. Otra desventaja de la producción de vacunas en huevos de gallina es que estas vacunas normalmente no están exentas de proteínas de gallina y, así, algunos pacientes pueden experimentar reacciones alérgicas. Por último, la posible selección de una subpoblación que difiere del virus de origen natural requiere de sistemas de células hospedadoras alternativos.

Contrariamente a los huevos de gallina, las células para la producción de vacunas antigripales basadas en cultivos celulares siempre están disponibles. Se almacenan congeladas y en se pueden descongelar rápidamente y reproducir en la cantidad necesaria bajo demanda. Así, la producción de vacunas puede iniciarse en cualquier momento deseado. En el caso de una demanda inesperadamente alta o cuando se propagan inesperadamente nuevas cepas de virus, es posible poner a disposición a corto plazo una vacuna apropiada.

El proceso de producción que usa cultivo celular permite la producción de virus como vacunas en un sistema cerrado normalizado en condiciones definidas y controladas. Debido al proceso de producción controlado, la vacuna antigripal terminada no requiere la adición de antibióticos. Puesto que la producción de las vacunas antigripales en cultivo celular es totalmente independiente de huevos, la vacuna producida de esta manera no tiene proteína de gallina y no puede provocar reacciones alérgicas debidas a sensibilidad en los pacientes.

En la actualidad, la producción de vacunas antigripales usa principalmente tres líneas celulares, a saber, las células PER.C6 humanas, las células Madin Darby Canine Kidney (MDCK) y las células de riñón de mono verde africano (Vero). Además, actualmente está en desarrollo una línea celular de retina de pato (AGE1.CR) y líneas de células madre embrionarias de ave. La producción de vacunas a partir de células de mamíferos representa una alternativa a la producción de vacunas basadas en huevos de gallina. Sin embargo, estas células requieren de suero y/o la adhesión a un soporte sólido para su proliferación. Esto dificulta y, por consiguiente, encarece la producción de las vacunas en estas células, puesto que, por motivos de seguridad, es necesario separar completamente el suero y la proliferación sobre soportes sólidos es limitada, conduciendo de este modo a menores rendimientos.

Una ventaja de la producción de vacunas en células de mamíferos consiste en que el aislamiento y la replicación del virus en el cultivo celular no genera una selección dependiente de pasajero de un fenotipo que difiere del tipo salvaje clínico. Por tanto, la glucoproteína viral hemaglutinina, por medio de la cual se efectúa la adhesión a la célula que se deberá infectar y la integración del virus en la célula, se expresa como una forma nativa; por ello, tiene una especificidad y avidez mejoradas; así, es posible una inmunidad mediada por células.

Por tanto, la invención tiene por objeto proporcionar líneas celulares humanas permanentes mejoradas para la producción de vacunas basadas en el virus de la gripe.

Este objeto se consigue mediante la materia objeto definida en las reivindicaciones.

Las Figuras ilustran la invención.

Las Figuras 1A a G muestran esquemáticamente el desarrollo de diferentes parámetros durante el cultivo de la línea celular de amniocitos permanentes CAP 1D5 en medio 293SFMII (), la línea celular de amniocitos permanentes

CAP 1D5 en medio PEM () y la línea celular de riñón canino permanente MDCK.SUS2 (Madin Darby Canine Kidney) en medio SMIF8 () en matraces vibratorios de 1 mi. La Figura 1A representa gráficamente el desarrollo del número comparado de células vivas de las tres líneas celulares; la Figura 1B muestra el desarrollo del número de células muertas de las líneas celulares; y la Figura 1C muestra el desarrollo de la tasa de supervivencia de las líneas celulares. Las Figuras 1D a G muestran esquemáticamente el desarrollo del valor pH (D), la concentración de glucosa (símbolos claros) y lactosa (símbolos oscuros) (E), de glutamina (Gln) (símbolos claros) y de amonio (símbolos oscuros) (F) y la concentración del ácido glutámico (Glu) (símbolos claros) y piruvato (símbolos oscuros) (G).

La Figura 2 muestra un gráfico de barras que representa los títulos virales medidos como valor TCID5 mediante 4 pase de las cepas del virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) y A/Uruguay/716/27 (H3N2) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII y PEM. Abreviaturas: A/PR 293: cepa de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; A/PR PEM: cepa de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) en células CAP-1D5 en medio PEM; A/Urug 293: cepa de la gripe A/Uruguay/716/27 (H3N2) en células CAP-1D5 en medio 293SFMII; A/Urug PEM: cepa de la gripe A/Uruguay/716/27 (H3N2) en células CAP-1D5 en medio PEM; el valor TCID5 es el título viral en número de virus/ml que se requiere para Infectar el 5 % de las células hospedadoras.

Las Figuras 3A a F muestran esquemáticamente el desarrollo de la cantidad de partículas de virus especificada como unidades log HA (hemaglutinina) /1 pl y el número de células vivas en el cultivo de amniocitos permanentes CAP-1D5 en medio 293SFMII (A, B) y PEM (C, D), y células de riñón canino permanentes MDCK.SUS2 en medio SMIF8 (E, F) tras la infección de las células con la cepa de virus de la gripe A/PR/8/34 con el uso de diferentes cantidades de virus indicadas como valores MOI (multiplicidad de Infección, por sus siglas en Inglés): MOI: ,25 (A); MOI: ,25 (); MOI: ,25 (O). MOI (multiplicidad de Infección) representa de nuevo la relación de número de partículas infecciosas respecto a células diana.

Las Figuras 4A a D muestran esquemáticamente el desarrollo de diferentes parámetros en el cultivo de la línea celular de amniocitos permanentes CAP-1D5 en medio PEM en el blorreactor de 1 litro, mientras que la infección tiene lugar después de 114 horas con una cantidad de virus indicada como MOI de ,25 con el virus de la gripe A/PR/8/34 (adaptado). La Figura 4A representa el desarrollo esquemático del número de células vivas (A), número de células muertas (A) y la tasa de supervivencia ( ®) de las células. En la Figura 4B se muestra esquemáticamente la cantidad de partículas de virus como unidades log HA (hemaglutinlna)/1 pl (A), concentración de glutamato (A) y piruvato (*) en el medio. La Figura 4C muestra esquemáticamente el desarrollo del valor pH (A) y a la Figura 4D muestra el desarrollo de la capacidad de infección... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe, que comprende:

a) infectar un amniocito humano permanente con un virus de la gripe;

b) cultivar el amniocito humano permanente;

c) expresar el virus de la gripe; y

d) aislar el virus de la gripe del medio,

en el que el amniocito humano permanente expresa los productos génicos adenovirales E1A y E1B.

2. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según la reivindicación 1, en el que el amniocito humano permanente se encuentra en la fase de proliferación exponencial o entre la fase de proliferación exponencial y la fase de proliferación estacionaria en el momento de la infección con el virus de la gripe.

3. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según la reivindicación 1, en el que el aislamiento del virus de la gripe del medio en la etapa d) se efectúa por centrifugación diferencial o zonal en gradiente de densidad.

4. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según la reivindicación 1, en el que los productos génicos adenovirales E1A y E1B comprenden los nucleótidos 1 a 4344, 55 a 3522 o los nucleótidos 55 a 479 del adenovirus humano serotipo-5.

5. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el amniocito humano permanente expresa el producto génico adenoviral pIX.

6. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que, antes de la infección con un virus de la gripe, tiene lugar un cambio completo de medio o una dilución 1:2 con medio.

7. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la infección con un virus de la gripe se añade una concentración de tripsina de 1 x 1'4 U/célula, 1 x 1'5 U/célula, 3x 1"5 U/célula, 5x 1"5 U/célula o 1 x 1'5 U/célula.

8. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que en la infección con un virus de la gripe se usa una cantidad de virus indicada como valor MOI en el intervalo de ,1 a ,3.

9. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de la gripe es un virus de la gripe humana, un virus de la gripe equina o un virus de la gripe porcina.

1. Procedimiento de producción de una vacuna a base de virus de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el virus de la gripe se selecciona de las cepas de virus de la gripe A/PR/8/34, A/Uruguay/716/27, A/Brisbane/59/27, B/Florida/4/26, gripe porcina (A/Swine (H1N2) Bakum/1832/) o gripe equina (A/Equine, A/Newmarket/1/93 (H3N8)).

11. Uso de un amniocito humano permanente para la producción de una vacuna a base de virus de la gripe, en el que el amniocito humano permanente expresa los productos génicos adenovirales E1A y E1B.