Procedimiento para la sensibilización y modificación de la superficie de electrodos de carbono.

Procedimiento para la sensibilización y modificación de la superficie de electrodos de carbono.

La presente invención da a conocer un procedimiento de sensibilización y modificación de la superficie de un electrodo de carbono que comprende las siguientes etapas: a) una primera etapa de sensibilización de la superficie de dicho electrodo de carbono y; b) una segunda etapa de modificación de la superficie de dicho electrodo de carbono utilizando una solución con un pH de neutro a básico, en presencia de urea y mediante ciclos repetitivos de potencial por voltamperometría.

Procedimiento para la sensibilización y modificación de la superficie de electrodos de carbono

La presente invención se refiere al sector de la química analítica, en particular a electrodos o sensores electroquímicos para la detección y diferenciación de analitos o especies biológicas fácilmente oxidables, específicamente a un procedimiento para la sensibilización y modificación de la superficie de electrodos de carbono mediante urea.

La determinación y medición de los niveles de los neurotransmisores dopamina (DA) y Levadopa (L-dopa) así como de los antioxidantes ácido ascórbico (AA) y ácido úrico (AU), son de gran interés clínico, en los campos de la neuroquímica y la química biomédica. La medición de los niveles de dichas sustancias en sistemas biológicos permite monitorizar el proceso de la neurotransmisión en el diagnóstico de diversos trastornos neurológicos (entre otros, Parkinson, Huntington, esquizofrenia), cardiovasculares, hiperuricemia y renales entre otros (Meiser, J., Weindl, D. y Hiller, K., Cell Commun Signal, 2013, 11, 1-18; Muñoz, P. y otros, Parkinsons Dis 2012, 2012, 1-13; Su, F. y otros, Chromatographia, 2009, 69, 207; Cannazza, G. y otros, J. Pharm. Biomed. Anal., 2012, 71, 183; Dreyer, D. R. y otros, Langmuir, 2012, 28, 6428; y Peaston, R. T. y Weinkove, C., Ann Clin Biochem, 2004, 41, 17-38). La detección y cuantificación de estas sustancias también es de interés en la industria farmacéutica para el control de la calidad de preparados farmacéuticos, extractos o bebidas que contienen substancias de interés biológico fácilmente oxidables tal como por ejemplo, quercetina, canferol y otros flavonoides.

Algunos de los procedimientos comúnmente utilizados para la determinación de estas sustancias son, entre otros, los fluorométricos, radioenzimáticos, cromatográficos, de electroforesis capilar y electroquímicos (Su, F. y otros, Chromatographia, 2009, 69, 207; Cannazza, G. y otros, J. Pharm. Biomed. Anal., 2012, 71, 183; y Peaston, R. T. y Weinkove, C., Ann Clin Biochem, 2004, 41, 17-38). Sin embargo, estos procedimientos requieren equipos costosos, una serie de preparativos previos y son lentos. De aquí el interés por el desarrollo de sensores electroquímicos a base de carbono, que son de bajo coste, rápidos de preparar y fácilmente pueden ser miniaturizados o bien ser preparados en diferentes formas geométricas.

La determinación simultánea de AU, AA y DA ha recibido una gran atención en las últimas décadas. Dado que AU, AA y DA son electroquímicamente muy activos (fácilmente oxidados), diversos métodos electroquímicos pueden ser empleados para la determinación simultanea de dichos compuestos. Los métodos electroquímicos tienen ciertas ventajas tales como su simplicidad, su rapidez, que son económicos y que presentan una gran sensibilidad. Sin embargo, el mayor problema es que la DA y el AA son oxidados a potenciales muy cercanos y son difícilmente distinguibles cuando se emplean electrodos sólidos (Babaei, A. y Taheri, A.R., Sens. Actuator. B-Chem., 2013, 176, 543; y Tsai, J.C., Huang, F.H. y Jason Chen, J.J., Sens. Actuator. B-Chem., 2013, 181, 179). Con el empleo de electrodos sólidos se da una superposición en la corriente de oxidación, dificultándose así la discriminación entre DA y AA.

Adicionalmente, los productos de oxidación pueden ser adsorbidos o electropolimerizados sobre la superficie del electrodo, afectando negativamente a la selectividad y reutilización de dichos electrodos (Chen, J.C. y otros, Sens. Actuator. B-Chem., 2005, 110, 364).

Los electrodos de carbono son conocidos en el estado de la técnica y se han utilizado comúnmente en el campo de la química electroanalítica y como sensores electroquímicos debido a su amplio intervalo de potencial, bajo coste, baja interferencia, facilidad para ser miniaturizados y alta sensibilidad (Vashist, S.K. y otros, Biotechnol. Adv., 2011, 29, 169).

El rendimiento analítico de dichos electrodos de carbono se ve afectado por el tipo de material de carbono y el procedimiento de pretratamiento o sensibilización utilizado. En este contexto los tipos de electrodos de carbono empleados con mayor frecuencia son los formados por materiales tales como carbono vitreo, carbono reticulado, pasta de carbono, fibra de carbono, carbono serigrafiado con nanotubos con pared múltiple, películas de carbono, diamante dopado con boro o con nitrógeno grafito pirolítico y fullerenos. Dichos electrodos de carbono pueden utilizarse para la detección de especies con actividad biológica en matrices complejas (Muñoz, P. y otros, Parkinson Dis 2012, 2012, 1-13; y Cannazza, G. y otros, J. Pharm. Biomed. Anal.,

2012, 71, 183).

Con el fin de resolver los problemas de selectividad, sensibilidad y reproducibilidad en la detección de especies biológicas fácilmente oxidables, tales como L-dopa, AU, DA y AA, la mayor parte de la atención se ha centrado en el empleo de diferentes electrodos de carbono, tales como los formados por fibras de carbono, pasta de carbono, nanotubos de pared múltiple y fullerenos. Alternativamente, para tratar de resolver los problemas anteriormente mencionados se han desarrollado también diversos procedimientos de tratamiento previo, sensibilización y modificación de la superficie de los electrodos de carbono (Vashist, S.K. y otros, Biotechnol. Adv., 2011, 29, 169; Nasirizadeh, N. y otros, Mater. Sci. Eng., 2013, C.33, 1491; Babaei, A., Taheri, A.R. y Farahani, I.K., Sens. Actuator. B-Chem., 2013,183, 265; Ózcan, A. y Sahin, Y., Biosens. Bioelectron., 2010, 25, 2497; lllinoiu, E.C. y otros, Sensors,

2013, 13, 7296; Xiao, C., Biosens. Bioelectron., 2011, 26, 2934; Kalimuthu, P. y John, A., Talanta, 2010, 80, 1686; Lin, L. y otros, Bioelectrochem., 2008, 73, 11; Sun, H., Zang, C. y Lian, K., Asian J. Pharm Sci., 2009, 4, 200; Temogin, Z., Sens. Actuator. B-Chem., 2013, 176, 796; Liu, S.Q., Sun, W.H. y Hu, F.T., Sens. Actuator. B-Chem., 2012, 173, 497; Quan, D.P. y otros, Colloid surf., 2011, B.88; Lin, S. y Chou, T.C., J. Electrochem. Soc., 2005, 152, H53; Sheng, Z.H. y otros, Biosens. Buioelectron., 2012, 34, 125; y Privett, B.J., Shin, J.H. y Schoenfisch, M.H., Electrochemical Sensors, 2010, 82, 4723).

Adicionalmente, en el documento de solicitud de Patente PCT W02010/111531 se da a conocer una estructura de sonda formada por tres electrodos: un contra electrodo, un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia y se contempla que el electrodo de trabajo esté formado por un sustrato de carbono y que se modifique con sustancias sensibles o insensibles a un analito (una o más), que tendrían propiedades redox y serían sensibles o insensibles a un analito de interés. En este documento se da a conocer la fijación de dichas sustancias mediante la inmovilización abrasiva, por evaporación, o por unión química, utilizando grupos reactivos.

En el documento de solicitud de Patente en Estados Unidos US2007/0237705 se da a conocer un sensor compuesto por un sustrato que se contempla que sea un metal, cristal, cuarzo, silicona o Si02/Si, sobre el que se colocan en dirección ortogonal nanotubos de carbono cuya superficie se puede modificar con moléculas que permitan la detección de diferentes analitos. Entre las moléculas contempladas en la modificación de la superficie de los nanotubos de carbono, se encuentran los clatratos, tales como la urea, que, según el procedimiento y electrodos dados a conocer en dicho documento, permitirían la detección de n-parafinas.

En el documento de solicitud de Patente PCT W02005/103664 se dan a conocer diversos procedimientos relacionados entre sí que permitirían obtener electrodos potenciométricos para la detección de analitos con la siguiente estructura y/o materiales: conexión eléctrica, partículas conductoras de la electricidad, tales como carbono, con concentración decreciente hacia la superficie del electrodo y moléculas ionóforos, tales como moléculas derivadas de la urea, con concentración creciente hacia la superficie del electrodo. Los procedimientos dados a conocer por este documento se basan en la utilización de diversas soluciones con concentraciones decrecientes de partículas conductoras de la electricidad y concentraciones crecientes de

moléculas ionóforo que se irían añadiendo y secando sucesivamente. Alternativamente, sobre la base de la pasta o sólido formado por la conexión eléctrica y las partículas conductoras de la electricidad se puede añadir la solución con moléculas ionóforo junto con un agente de curado para proceder al desgasado y calentamiento de la construcción para obtener el gradiente mencionado anteriormente.

En el documento de solicitud de Patente PCT WO2005/085825 se dan a conocer los siguientes procedimientos para la sensibilización y modificación...

1. Procedimiento de sensibilización y modificación de la superficie de un electrodo de carbono caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

c) una primera etapa de sensibilización de la superficie de dicho electrodo de carbono; y

d) una segunda etapa de modificación de la superficie de dicho electrodo de carbono utilizando una solución con un pH de neutro a básico, en presencia de urea y mediante ciclos repetitivos de potencial por voltamperometría.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho electrodo de carbono está hecho de un material seleccionado del grupo que comprende carbono vítreo, carbono reticulado, pasta de carbono, fibra de carbono, carbono de alta pureza comercial compacto, polvo de carbono de origen vegetal, mineral o serigrafiado, carbono serigrafiado con nanotubos con pared múltiple, películas de carbono, diamante dopado con boro o con nitrógeno grafito pirolítico, fullerenos, material compuesto de carbono-cloruro de polivinilo o combinaciones de los mismos.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho electrodo de carbono está hecho de material compuesto de carbono-cloruro de polivinilo.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho electrodo de carbono está hecho de carbono serigrafiado con nanotubos de pared múltiple.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono se utiliza una solución con un pH de neutro a básico junto con ciclos repetitivos de potencial por voltamperometría.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha solución con un pH de neutro a básico utilizado en la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono es una solución de hidróxido de potasio con una concentración entre 0,1 M y 5 M.

7. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha solución con un pH de neutro a básico utilizado en la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono es tampón fosfato a pH 7,4.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono se realiza mediante impregnación del electrodo con un metal y, a continuación, se aplican ciclos repetitivos de potencial por voltamperometría utilizando una solución con un pH de neutro a básico.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho metal utilizado es níquel en forma de p-Ni(OH)2.

10. Procedimiento, según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho p-Ni(OH)2 está en forma de polvo o nanopartículas.

11. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la solución con un pH de neutro a básico es una solución de hidróxido de potasio a una concentración entre 0,1 M y 5 M.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la solución con un pH de neutro a básico es tampón fosfato a pH 7,4.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, caracterizado porque dicha voltamperometría de la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono es voltamperometría diferencial de pulso o voltamperometría cíclica.

14. Procedimiento, según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha voltamperometría diferencial de pulso o dicha voltamperometría cíclica de la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono se realiza a una velocidad de barrido entre 1 y 300 mV/s y en un intervalo de potenciales de -200 a 900 mV.

15. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, caracterizado porque dichos ciclos repetitivos de potencial de la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono se realizan mediante entre 2 y 50 ciclos.

16. Procedimiento, según la reivindicación 15, caracterizado porque dichos ciclos repetitivos de potencial de la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono se realizan mediante entre 2 y 10 ciclos.

17. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque tras realizar la etapa a) de sensibilización de la superficie del electrodo de carbono dicho electrodo se lava de 5 a 10 veces por inmersión en agua desionizada.

18. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque dicha solución con un pH de neutro a básico utilizada en la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono es una solución de hidróxido de potasio a una concentración entre 0,1 M y 5 M.

19. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque dicha solución con un pH de neutro a básico utilizada en la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono es tampón fosfato a pH 7,4.

20. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque dicha voltamperometría de la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono es voltamperometría diferencial de pulso o voltamperometría cíclica.

21. Procedimiento, según la reivindicación 20, caracterizado porque dicha voltamperometría diferencial de pulso o dicha voltamperometría cíclica de la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono se realiza a una velocidad de barrido entre 1 y 300 mV/s y en un intervalo de potenciales de -200 a 1000 mV.

22. Procedimiento, según la reivindicación 21, caracterizado porque dicha voltamperometría cíclica de la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono se realiza a una velocidad de barrido de 20 mV/s y en un intervalo de potenciales de -200 a 750 mV.

23. Procedimiento, según la reivindicación 21, caracterizado porque dicha voltamperometría diferencial de pulso de la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono se realiza a una velocidad de barrido de 2,7 mV/s y en un intervalo de potenciales de -200 a 750 mV.

24. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque en dicha etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono se utiliza una solución de urea con una concentración entre 0,1 y 0,8 M.

25. Procedimiento, según la reivindicación 24, caracterizado porque en la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono se utiliza una solución de urea con una concentración entre 0,1 y 0,5 M.

26. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque tras la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono dicho electrodo se lava de 5 a 10 veces por inmersión en agua desionizada y se deja reposar de 2 a 4 horas a temperatura ambiente.

27. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque tras la etapa b) de modificación de la superficie del electrodo de carbono dicho electrodo se coloca en una celda electroquímica con un tampón fosfato a pH entre 5,0 y 7,4.

28. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque adicionalmente comprende una etapa c) en la que dicho electrodo se sensibiliza mediante voltamperometría lineal en presencia de medio básico.

29. Procedimiento, según la reivindicación 28, caracterizado porque el medio comprende adicionalmente etanol.

30. Procedimiento, según la reivindicación 28 ó 29, caracterizado porque dicha voltamperometría lineal se realiza a una velocidad de barrido entre 0,01 y 5 mV/s y en un intervalo potenciales anódicos de 400 a 950 mV.

31. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque la sensibilización de la etapa c) se realiza durante de 1 a 5 horas.

32. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque tras la etapa c) el electrodo se lava de 5 a 10 veces por inmersión en agua desionizada y se deja reposar de 1 a 15 días a temperatura ambiente.

33. Electrodo de carbono generado por un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.

34. Electrodo de carbono, según la reivindicación 33, caracterizado porque se puede reutilizar varias veces.

35. Electrodo de carbono, según la reivindicación 34, caracterizado porque se puede reutilizar 5 veces.

36. Uso de un electrodo de carbono según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35 para la detección y cuantificación de analitos o especies biológicas en una muestra.

37. Uso, según la reivindicación 36, caracterizado porque dicho analito o especie biológica se selecciona del grupo que comprende antioxidantes, neurotransmisores, flavonoides o combinaciones de los mismos.

38. Uso, según la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque dicho analito o especie biológica es Levodopa, dopamina, ácido úrico, benserazida, ácido ascórbico o combinaciones de los mismos.