Un procedimiento para la determinación de un agonista colinérgico selectivo para un receptor alfa7 nicotínico.

Un procedimiento para determinar si un compuesto es un agonista colinérgico selectivo para un receptor a7 nicotínico,

comprendiendo el procedimiento determinar si el compuesto inhibe la liberación del factor de necrosis de tumor (TNF) desde un macrófago, y

determinar si el compuesto es un agonista colinérgico reactivo con por lo menos un receptor nicotínico que no es α7, en el que el compuesto que inhibe la liberación del TNF desde un macrófago, pero que no es un agonista colinérgico reactivo con por lo menos un receptor nicotínico que no es α7, y que activa alfa 7 a una medida más grande que el compuesto que activa el por lo menos otro receptor nicotínico, es un agonista colinérgico selectivo para un receptor α7 nicotínico.

Un procedimiento para la determinación de un agonista colinérgico selectivo para un receptor a7 nicotínico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los vertebrados consiguen la homeostasia interna durante una infección o lesión equilibrando las actividades de las rutas proinflamatorias y antiinflamatorias. Sin embargo, en muchos estados patológicos, esta homeostasia interna se desequilibra. Por ejemplo, la endotoxina (lipopolisacárido, LPS) producida por todas las bacterias gram-negativas activa los macrófagos para liberar citocinas que son potencialmente mortales (Tracey et al., 1986; Wang et al., 1999; Nathan, 1987; Dinarello, 1994) .

La inflamación y otros estados perjudiciales (tales como choque séptico producido por la exposición a la endotoxina) están inducidos con frecuencia por citocinas proinflamatorias, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF; también conocido como TNFa o caquectina) , interleucina (IL) -1a, IL-1º, IL-6, IL-8, IL-18, interferón-v, factor activador de las plaquetas (PAF) , factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) y otros compuestos (Thompson, 1998) . Otros determinados compuestos, por ejemplo, proteína 1 del grupo de alta movilidad (HMG-1) , se inducen durante diversos estados tales como sepsis y también pueden servir como citocinas proinflamatorias (publicación PCT WO 00/47104) . Estas citocinas proinflamatorias se producen por varios tipos celulares diferentes, de la manera más importante por las células inmunitarias (por ejemplo monocitos, macrófagos y neutrófilos) , pero también células no inmunitarias tales como fibroblastos, osteoblastos, células del músculo liso, células epiteliales y neuronas (Zhang y Tracey, 1998) . Las citocinas proinflamatorias contribuyen a diversos trastornos, en particular sepsis, a través de su liberación durante una cascada de citocinas inflamatorias.

Las cascadas de citocinas inflamatorias contribuyen a características perjudiciales, incluyendo la inflamación y la apoptosis (Pulkki, 1997) , de numerosos trastornos. Se incluyen trastornos caracterizados por reacciones tanto localizadas como sistémicas, incluyendo, sin limitación, enfermedades que implican el tracto gastrointestinal y tejidos asociados (tales como apendicitis, úlceras pépticas, gástricas y duodenales, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerosa, colitis pseudomembranosa, aguda e isquémica, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, enfermedad celíaca, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis y enfermedad de Whipple) ; enfermedades y estados inflamatorios locales o sistémicos (tales como asma, alergia, choque anafiláctico, enfermedad por complejos inmunitarios, isquemia de un órgano, lesión por reperfusion, necrosis de un órgano, rinitis alérgica primaveral, sepsis, septicemia, choque endotóxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinófilo, granulomatosis y sarcoidosis) ; enfermedades que implican el aparato genitourinario y tejidos asociados (tales como aborto séptico, epididimitis, vaginitis, prostatitis y uretritis) ; enfermedades que implican el aparato respiratorio y tejidos asociados (tales como bronquitis, enfisema, rinitis, fibrosis quística, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, neumonía, silicovulcanoconiosis neumoultramicroscópica, alveolitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresía y sinusitis) ; enfermedades que surgen de la infección por diversos virus (tales como influenza, virus respiratorio sincitial, VIH, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y herpes) , bacterias (tales como bacteriemia diseminada, dengue) , hongos (tales como candidiasis) y parásitos protozoarios y multicelulares (tales como malaria, filariasis, amebiasis y quistes hidatídicos) ; enfermedades y estados dermatológicos de la piel (tales como quemaduras, dermatitis, dermatomiositis, quemadura solar, urticaria, verrugas y ronchas) ; enfermedades que implican el sistema cardiovascular y tejidos asociados (tales como vasculitis, angitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocárdica, insuficiencia cardíaca congestiva, periarteritis nudosa y fiebre reumática) ; enfermedades que implican el sistema nervioso central o periférico y tejidos asociados (tales como la enfermedad de Alzheimer, meningitis, encefalitis, esclerosis múltiples, infarto cerebral, embolia cerebral, síndrome de Guillame-Barre, neuritis, neuralgia, lesión de la médula espinal, parálisis y uveítis) ; enfermedades de los huesos, las articulaciones, los músculos y tejidos conjuntivos (tales como las diversas artritis y artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide y sinovitis) ; otros trastornos autoinmunitarios e inflamatorios (tales como miastenia grave, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Goodpasture, síndrome de Behcet, rechazo de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, diabetes tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, diabetes tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger y síndrome de Retier) ; así como diversos cánceres, tumores y trastornos proliferativos (tales como enfermedad de Hodgkin) ; y, en cualquier caso, la respuesta inmunitaria o inflamatoria del huésped frente a cualquier enfermedad primaria (Gattorno et al., 2000; Yeh y Schuster, 1999; McGuinness et al., 2000; Hsu et al., 1999; Pr y stowsky y Rege, 1997; Kimmings et al., 2000; Hirano, 1999; Lee et al., 1995; Waserman et al., 2000; Katagiri et al., 1997; Bumgardner y Orosz, 1999; Dibbs et al., 1999; Blum y Miller, 1998; Blackwell y Christman, 1996; Fox, 2000; Carteron, 2000; Hommes y van Deventer, 2000; Gracie et al., 1999; Kanai et al., 2001; Jander y Stoll, 2001; Watanabe et al., 1997; Rayner et al., 2000; Amrani et al., 2000) .

Los mamíferos responden a la inflamación producida por las cascadas de citocinas inflamatorias en parte a través de la regulación por el sistema nervioso central. Esta respuesta se ha caracterizado en detalle con respecto a mecanismos de respuesta humoral sistémica durante las respuestas inflamatorias a endotoxina (Besedovsky et al., 1986; Woiciechowsky et al., 1998; Hu et al., 1991; Lipton y Catania, 1997) . En un grupo de respuestas, se activan fibras aferentes del nervio vago por la endotoxina o citocinas, estimulando la liberación de respuestas antiinflamatorias humorales a través de la liberación de la hormona glucocorticoide (Watkins y Maier, 1999; Sternberg, 1997; Scheinman et al., 1995) . El trabajo previo dilucidó un papel de la señalización del nervio vago como un componente crítico en el asa aferente que modula las respuestas de fiebre y adrenocorticotropina frente a citocinemia y endotoxemia sistémicas (Gaykema et al., 1995; Fleshner et al., 1998; Watkins et al., 1995; Romanovsky et al., 1997) .

Otro grupo de respuestas es a través de la señalización del nervio vago eferente, denominada la "ruta antiinflamatoria colinérgica" (Borovikova et al., 2000) . La estimulación del nervio vago eferente atenúa las respuestas inflamatorias sistémicas e inhibe la liberación de TNF (íd.; Bernik et al., 2002; Tracey et al., 2001; solicitud de patente estadounidense número 09/855.446) . La acetilcolina, el principal neurotransmisor del nervio vago, atenúa la síntesis de citocinas por macrófagos mediante la señalización a través de receptores nicotínicos de acetilcolina sensibles a a-bungarotoxina, pero se desconoce la identidad del receptor de macrófagos esencial.

Los receptores nicotínicos de acetilcolina son una familia de canales iónicos pentaméricos, controlados por ligando. En los seres humanos, se han identificado 16 subunidades diferentes (a1-7, a9-10, 1-4, 5, \varepsilon y v) que forman un gran número de receptores homo y heteropentaméricos con propiedades estructurales y farmacológicas diferenciadas (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001; Le Novere y Changeux, 1995) . La principal función conocida de esta familia de receptores es transmitir señales para el neurotransmisor acetilcolina en las uniones neuromusculares y en los sistemas nervioso central y periférico (Lindstrom, 1995; Leonard y Bertrand, 2001; Le Novere y Changeux, 1995, Marubio y Changeux, 2000; Steinlein, 1998) . El trabajo previó indicó la presencia de receptores nicotínicos sensibles a a-bungarotoxina en macrófagos primarios humanos (Borovikova et al., 2000) , pero se desconoce la identidad de la subunidad del receptor específica.

El conocimiento del receptor nicotínico particular que es responsable de inhibir la inflamación sería útil para identificar agonistas específicos del receptor que inhibirían la inflamación. Es probable que tales agonistas tengan menos efectos secundarios que los agonistas identificados actualmente que son relativamente inespecíficos. También se... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar si un compuesto es un agonista colinérgico selectivo para un receptor a7 nicotínico, comprendiendo el procedimiento determinar si el compuesto inhibe la liberación del factor de necrosis de tumor (TNF) desde un macrófago, y

determinar si el compuesto es un agonista colinérgico reactivo con por lo menos un receptor nicotínico que no es a7, en el que el compuesto que inhibe la liberación del TNF desde un macrófago, pero que no es un agonista colinérgico reactivo con por lo menos un receptor nicotínico que no es a7, y que activa alfa 7 a una medida más grande que el compuesto que activa el por lo menos otro receptor nicotínico, es un agonista colinérgico selectivo para un receptor a7 nicotínico.

2. El procedimiento según la reivindicación 1 que comprende además tratar el macrófago con un reactivo que estimula una cascada de TNF.

3. El procedimiento según la reivindicación 2 en el que el reactivo es LPS.

4. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la determinación de la inhibición de la liberación de TNF 15 comprende la medición de ARNm del TNF.

5. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la determinación de la inhibición de la liberación de TNF comprende la medición de la proteína del TNF.

6. El procedimiento según la reivindicación 1 en el que la determinación de la inhibición de la liberación de TNF

comprende la medición de la actividad del TNF. 20

Nicotina