Inmunoensayo para antidepresivos basados en N-(3-clorofenil)piperazina.

Un anticuerpo utilizado para detectar o determinar N-(3-clorofenil)piperazina y N'-sustituidas-N-(3- clorofenil)piperazinas en una solución o en una muestra in vitro tomada de un paciente,

que se caracteriza por haber sido producida a partir de un inmunógeno de estructura I y además también se caracteriza por ser capaz de unirse a un epítopo de N-(3-clorofenil)piperazina o la fracción N-(3-clorofenil)piperazina de una N'-sustituida N-(3- clorofenil)piperazina.

Estructura I, donde "accm" es la abreviatura de material portador que confiere antigenicidad.

Inmunoensayo para antidepresivos basados en N-(3-clorofenil)piperazina Antecedentes de la invención

La trazodona, nombre sistemático 2-{3-[4-(3-clorofenil)-1-piperazinil]propil}-[1,2,4]triazol[4,3-a]piridin-3(2/-/)-ona, es un antidepresivo con una actividad ansiolítica e hipnótica que metaboliza el hígado mediante hidroxilación, N-oxidación y desalquilación, provocando esta última transformación la aparición de un metabolito importante N-(3- clorofeniljpiperazina. La ingestión aguda de trazodona, cuando va acompañada de otros medicamentos, se ha asociado a toxicidad y a sobredosis mortales (por ejemplo, Balestrieri et al 1992; Goeringer et al 2000; Haria et al. 1994; de Meester et al 2001; Martínez et al 2005).

La nefazodona, nombre sistemático 2-{3-[4-(3-clorofenil)-1-piperazinil]propil}-5-etil -4-(2-fenoxietil)-1,2,4-triazol-3-ona, es un medicamento antidepresivo que se ha asociado a reacciones adversas de carácter hepático y a mortalidad, así como al síndrome de serotonina (Mayol et al 1994; John et al 1997). La N-(3-clorofenil)piperazina se detecta en la orina a las veinticuatro horas de haber tomado nefazodona, pero la mayor parte de los metabolitos en la orina son metabolitos de nefazodona sin la estructura N-(3-clorofenil)piperazina. El principal metabolito de la nefazodona es el 1 -{3-[4-(3-clor°fenil)-1 -piperazinil]pr°pil-4-(2-fenoxietil)- 1,2,4-triazol-3,5-diona (Punit et al 1996). Entra otras N1- sustituidas- N-(3-clorofenil)piperaz¡nas cabe destacar etoperidona, mepiprazol, cloperidona y mefeclorazina.

El potencial de provocar efectos adversos o fatales en personas que lo toman, o que tienen acceso a trazodona y nefazodona, exige la necesidad de llevar a cabo una toxicología clínica y forense para su detección y determinación, utilizando métodos analíticos prácticos y poco costosos. Entre los métodos analíticos que han sido utilizados para detectar y determinar trazodona, nefazodona y sus metabolitos, cabe citar la HPLC, HPLC-MS, GC, GC-MS y electrodos molécula-selectivos. La N-(3-clorofenil)piperaz¡na tomada para fines no medicinales, Incluidos sus métodos de detección, se analiza en la publicación encargada por el EMCDDA (2007).

Las reacciones específicas de uniones, como por ejemplo las interacciones antlcuerpo-antígeno, se han utilizado ampliamente en los inmunoensayos para detectar una variedad de sustancias presentes en las muestras biológicas. Comparados con los métodos tales como la HPLC y GC-MS, estos métodos son menos costosos, no requieren personal especializado y se pueden realizar en entornos fuera del laboratorio, como por ejemplo en una varilla. Por ello, se pueden utilizar radioinmunoensayos (RIA) para la determinación de trazodona, nefazodona y moléculas compuestas o que contengan estructuras N-(3-clorofen¡l)p¡peraz¡na o N'-sustltuldas- N-(3-clorofenil)piperazinas como la mepiprazola y la etoperidona. Los radioinmunoensayos son muy sensibles, pero requieren trazadores de radionucleidos, como por ejemplo 125l y 3H. Los ensayos de inmunoabsorción enzimática (ELISA) son una alternativa no radioactiva que se podría utilizar para su determinación cualitativa y cuantitativa. No existen RIA o ELISA para la trazodona, nefazodona o ninguna otra molécula compuesta por estructuras N-(3-clorofenil)piperazina o N-sustituidas- N-(3-clorofenil)piperazinas, o que contenga las mismas. De Boer et al (2001) Investigan el análisis de diversas estructuras (es decir, moléculas que no contienen la estructura N-(3-clorofenll)plperaz¡na) 1-benzllplperazlna (BZP), 1-(4-metoxlfenll)piperazina, ni 1-(3- trifluorometilfeniljpiperazina utilizando varias técnicas analíticas, Incluidos los Inmunoensayos que se comercializan para las anfetaminas. En uno de los inmunoensayos se observó una muy baja reactividad cruzada a altas concentraciones de BZP.

Para poder detectar la trazodona, la nefazodona y las moléculas relacionadas con las mismas o que contengan estructuras N-(3-clorofenll)plperazina o N'-sustltuldas- N-(3-clorofenll)plperaz¡na para fines clínicos, toxicológicos y forénsicos, se requiere una prueba económicamente viable, práctica, sensible y consistente. La invención aquí descrita posee estos atributos.

Bibliografía

Balestrieri G. etal (1992). Br. Med. J., 304: 686.

Goeringer K.E. et al (2000). J. Forenslc Sci., 45: 850-856.

Mayol R.F. etal (1994). Drug Metab. Dlspos., 22: 304-311. de Meester A. et al (2001). Act. Clin. Belg., 56: 258-261.

Haria M. et al (1994). Drugs and Aging, 4: 331-335.

Punit M.H. (1996). Br. J. Clin. Pharmacol., 41: 21-27.

John L. (1997). Ann. Emerg. Med., 29: 287-289.

Martínez M.A. et al (2005). J. Anal. Toxicol. , 29: 262-268. de Boer D. et al (2001). Forensic Sci. Int., 121: 47-56.

EMCDDA (2007). Anexo 1 Información Técnica: m-Clorofenilpiperazina (mCPP), informe de control Europol- EMCDDA de una nueva sustancia psicoactiva 1-(3-clorofenil)piperazina (mCPP), ed. European Monitoring

Centre for Drugs and Drug Addiction.

Seguela P. et al. (1984). Proc. Nati. Acad. Sci., 81: 3888-3892.

Compendio de la invención

La invención es una solución al problema de la no existencia de una prueba analítica para la trazodona, nefazodona, N-(3-clorofenil)piperazina y N-sustituidas- N-(3-clorofenil)pipereazinas que sea económicamente viable, práctica, sensible y consistente. La solución requiere el uso de un anticuerpo específico que se una a una N-(3- clorofenil)piperazina y N-sustituidas- N-(3-clorofenil)piperazinas.

Figura 1 Síntesis del hapteno 6-[N'-(3-clorofenil)-N-piperazinil]ácido hexanoico descripción detallada de la invención

Un primer aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo que se une a un epítopo de N-(3-clorofenil)piperazina o epítopo de la estructura N-(3-clorofenil)piperazina en una N'-sustituida- N-(3-clorofenil)piperazina para detectar o determinar la N-(3-clorofenil)piperazina o las N'-sustituidas- N-(3-clorofenil)piperazinas en una solución o en una muestra in vitro tomada de un paciente. El anticuerpo se produce a partir de un inmunógeno de la estructura

donde el agente de reticulación se une al N'-átomo del anillo piperazinil al accm, un material portador que confiere antigenicidad. El agente de reticulación del Inmunógeno del que se produce el anticuerpo es -X-Y- donde X es una fracción de alquileno de cadena lineal C1-C10, más preferiblemente C2-C6, y aún más preferiblemente C5 sustituida o no sustituida, o fracción de arileno e Y (antes de la conjugación con el accm) se selecciona de un carboxi, ditiopiridilo, maleimida, amino, hidroxilo, tiol, tioéster o una fracción de aldehido, más preferiblemente una porción de carboxi. El accm puede ser cualquier material que hace que la totalidad o parte de la estructura N-(3-clorofenil)piperazina sea susceptible para la identificación del anticuerpo y la unión. Por ejemplo, el accm puede ser una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético o un polipéptido semisintético. El anticuerpo puede ser monoclonal, pero es preferible que sea policlonal. La N'-sustltulda- N-(3-clorofenil)piperazina es preferentemente una o más moléculas de trazodona, nefazodona y 1 -{3-[4-( 3-cl or ofe nil1)-1-pipe r azi ni I] pro pi l}-4-(2-fe n oxi eti I)-1,2,4-triazol-3,5-diona.

Otro aspecto de la invención es un método para detectar o determinar la N-(3-clorofenll)plperazina o N'-sustituidas- N-(3-clorofenil)piperazinas en una solución o una persona, método que consiste en poner en contacto una muestra in vitro extraída de una persona, o la solución, con un conjugado, y un anticuerpo que se une a un epítopo de N-(3- clorofeniljpiperazina o un epítopo de la estructura N-(3-clorofenil)piperazlna en una N'-sustltulda- N-(3- clorofeniljpiperazina, detectando el conjugado unido, y deduciendo de los valores de calibración la presencia de un volumen determinado de N-(3-clorofenil)piperazina o uno o más N'-sustituidas- N-(3-clorofenil)piperazinas. Preferiblemente la N'-sustitulda- N-(3-clorofenil)piperazina es una o más moléculas de trazodona, nefazodona y 1-{3- [4-( 3-cl o rofe n i I)-1 - pi pe razi n i I ] pro pi I )-4-(2-fe n oxi eti I)-1,2,4-tri azol-3,5-di o n a.

Otro aspecto de la invención es un kit para detectar o determinar la N-(3-clorofenll)plperazina o las N'-sustltuldas- N- (3-clorofenil)piperazinas, incluyendo el kit un anticuerpo que se une a un epítopo de N-(3-clorofeníl)píperaz¡na o un epítopo de la estructura N-(3-clorofenll)plperazina en una N'-sustituida- N-(3-clorofenil)piperazina. Preferiblemente la N'-sustltuida- N-(3-clorofenil)piperaz¡na es una o más moléculas de trazodona, nefazodona y 1-{3-[4-(3-clorofenil)-1- piperaziniljpropil )-4-(2-fe n oxi eti I)- 1,2,4-triazol-3,5-diona. El kit puede incluir instrucciones para... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo utilizado para detectar o determinar N-(3-clorofenil)piperazina y N'-sustituidas-N-(3- clorofenil)piperazinas en una solución o en una muestra in vitro tomada de un paciente, que se caracteriza por haber sido producida a partir de un inmunógeno de estructura I y además también se caracteriza por ser capaz de unirse a 5 un epítopo de N-(3-clorofenil)piperazina o la fracción N-(3-clorofenil)piperazina de una N'-sustituida N-(3- clorofenil)piperazina.

accm

N

y Agente de reticulación

Cl

Estructura I, donde "accm" es la abreviatura de material portador que confiere antigenicidad.

2. El anticuerpo de la Reivindicación 1 en el que el agente de reticulación del inmunógeno a partir del cual se 10 produce el anticuerpo es -X-Y- donde X es una fracción de alquileno de cadena lineal C1-C10, más preferiblemente

C2-C6, y aún más preferiblemente C5 sustituida o no sustituida, o fracción de arileno e Y (antes de la conjugación con el accm) se selecciona de un carboxi, ditiopiridil, maleimida, amino, hydroxll, tiol, tioéster o una fracción de aldehido, más preferiblemente una fracción de carboxi.

3. El anticuerpo de la Reivindicación 1 o 2 en la que la N'-sustltulda- N-(3-clorofenil)plperaz¡na es una o más 15 moléculas de trazodona, nefazodona y 1-{3-[4-(3-clorofen¡l)-1-p¡peraz¡n¡l]propil)-4-(2-fenox¡et¡l)-1,2,4-trlazol-3,5-

diona.

4. Un método para detectar o determinar la N-(3-clorofenil)piperazlna y N'-sustituidas- N-(3- clorofenil)piperazinas en una persona o una solución, el método consistente en poner en contacto una muestra in vitro tomada de una persona o una solución con un conjugado y el anticuerpo de las Reivindicaciones 1 o 2,

detectando el conjugado unido y deduciendo de los valores de calibración la presencia de un determinado volumen de N-(3-clorofenil)piperazina o una o más N'-sustltuidas N-(3-clorofenil)piperazinas.

5. El método de la Reivindicación 4 en la que la N'-sustituida- N-(3-clorofenil)piperazina es una o más moléculas de trazodona, nefazodona y 1-{3-[4-(3-clorofenil)-1-piperazinil]propll)-4-(2-fenox¡et¡l)- 1,2,4-trlazol-3,5- dlona.

6. Un kit para detectar o determinar la N-(3-clorofenil)piperazina y las N'-sustltuldas- N-(3-clorofenll)plperaz¡nas. El

kit Incluye el anticuerpo de las reivindicaciones 1 o 2.

7. El kit contiene la Reclamación 6 en la que la N'-sustituida- N-(3-clorofenil)piperazina es una o más moléculas de trazodona, nefazodona y 1-{3-[4-(3-clorofenil)-1-plperazinil]propil)-4-(2-fenoxiet¡l)- 1,2,4-triazol-3,5-dlona.