Inmunoensayo de zolpidem con ventana de detección extendida.

Un inmunógeno de la estructura**Fórmula**

en donde

accm es un material transportador que confiere antigenicidad;

n≥ 0 ó 1; X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o alquileno de cadena lineal, sustituido o sin sustituir, de C1-10, preferiblemente de C2-6; Z es, antes de la conjugación con el accm, carboxi, ditiopiridilo, maleimida, amino, hidroxílo, tiol, tioéster o un resto aldehído.

Inmunoensayo con zolpiden con ventana de detección extendida Antecedentes de la invención El zolpidem, de nombre istemático N, N-dimetil-2[-6-metil-2- (4-metilfenil) imidazo[1, 2-a]piridina-3-il]acetamida, es un fármaco prescrito con frecuencia para combatir los trastornos neurológicos y del sueño, especialmente el insomnio. El fármaco está clasificado como un hipnótico no benzociiazepínico, y actúa sobre los receptores del ácido aminobutírico gabba. Tras su ingestión, el zolpidem actúa rápidamente y tiene una vida media de 1, 5 a 3 h. El metabolismo se lleva a cabo gracias al citocromo P450, produciendo más del 80 % del ácido 4-[3- (2-N, Ndimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo-[1, 2-a]piridina-2-il] benzoico (M1) , formado a través del correspondiente metabolito hidroxi y una cantidad relativamente pequeña de ácido 3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -2-{4metilfenil) imidazo[1, 2-a]piridin-6-il carboxílico (1-4) . A pesar de su eficacia terapéutica demostrada han aumentado las denuncias por problemas de dependencia y abuso para fines delictivos y estimulantes (5-7) y de los efectos secundarios que amenazan la vida debido por las alucinaciones que provoca y porque afecta a la conducción (8) . Villain et al (9) informó de que el zolpidem ocupaba el primer lugar en una lista de fármacos utilizados en agresiones sexuales facilitadas por fármacos. Este potencial de abusos o sucesos adversos en individuos que lo toman o ue tienen acceso a zolpidem crea una necesidad de que se lleve a cabo una toxicología clínica y forense para su detección y/o determinación, utilizando métodos analíticos prácticos y asequibles. Los métodos analíticos que se han utilizado para detectar e identificar el zolpidem incluyen HPLC, LC-MS-MS, GC y GC-MS. Un método de HPLC con columnas de conmutación, complejo, que emplea un gran equipo técnico y que incorpora una fase de limpieza y de preconcentración con M1 como marcador de sobredosis, ya que es el marcador de zolpidem más abundante en plasma y orina (1) . Se describe un método GC-MS que implica la extracción de la muestra y una derivatización del compuesto para detectar el M1 en un plazo máximo de 72 horas en dos casos de presunta agresión facilitada por fármacos con zolpidem (10) . El inmunoensayo más económico y más práctico también se ha empleado para detectar y cuantificar el zolpidem. El inmunoensayo presenta muchas ventajas respecto a otros formatos analíticos habituales, como la GC-MS y la LC-MS en cuanto a costes, facilidad de uso y su flexibilidad para fabricarse en un formato portátil y compacto para su uso en el terreno. Se han descrito un radioinmunoensayo (RIA) y un ensayo de tipo EMIT. El RIA describe un inmunógeno en el que el agente de reticulación de proteínas se incorpora en la posición 3 del heterociclo condensado, detectándose así el zolpidem, sin que se haya informado de ningún tipo de reactividad cruzada con los metabolitos (11) . El RIA es extremadamente sensible, pero lleva asociados factores de salud y seguridad. Por lo general, los RIA tienen poca aceptación comercial y los inventores desconocen que exista un RIA para zopidelm. Existe un kit disponible en el mercado para la detección forense de zolpidem en sangre entera, suero y orina, con un valor umbral de detección de 25 ng/ml (prospecto de inmunoanálisis ELISA de zolpidem, catálogo 233) . Se ha informado de que el kit no detecta M1 a 1000 ng/ml (8) . En un inmunoensayo de seguimiento desarrollado por la misma compañía para la detección de zolpidem en la orina se observa un límite de detección de 5 ng/ml y una ventana de detección de ocho horas en una persona descrita como consumidora no frecuente; transcurridas 16 horas, el zolpidem no se pudo detectar (12) . Un kit ELISA comercial fabricado por International Diagnostic Systems detecta zolpidem a 75 ng/ml. Ninguno de los kits notificó la detección de M1.

Lamont (13) describió un anticuerpo y un inmunoensayo sensible a zolpidem que no poseía reactividad cruzada con M1.

Debido a que el metabolismo del zolpidem es rápido y varía entre distintas personas (8, 9, 12) , los presentes immunoensayos detectan únicamente la molécula original no tienen la sensibilidad suficiente para poder utilizarse de forma fiable como herramienta para detectar el uso indebido de zolpidem o de estar conduciendo bajo sus efectos en muestras de pacientes que se recogieron aproximadamente más allá de 8-24 horas. Para resolver esta incompatibilidad, los inventores idearon y diseñaron un inmunoensayo basado en la detección del zolpidem y su metabolíto principal M1. La presente invención permite la detección y determinación inmunosensible del zolpidem y de su metabolíto principal en muestras de pacientes y extiende el periodo de tiempo de detección del zolpidem en el que puede ser detectado tras su ingestión.

Bibliografía

1. Ascalone V. et al. (1992;. J. Chromatogr. 581: 237-250

2. Hempel G. y Blaschke G. (1996) . J. Chromatogr, B 675:131-137

3. von Moltke L. et al. (1999) . Br. J. Clin, Pharmacol. 48: 89-97

4. Salva P. y Costa J. (1995) . Clin Pharmacokin. 29:142-153

5. Madea B. y Muβhoff F. (2009) . Dtsch. Autebl. Int. 106:341-347

6. Maravelias C et al. (2009) . Am. J. Forensic Med. Pathol 30: 384-385

7. Victorri-Vigneau C. et al. (2007) . Br. J. Clin. Pharmacol. 64:198-209

8. Reidy L. et al (2008) . J. Anal. Tox. 32: 688-694

9. Villain M. et al. (2004) . Forensic Sci, Int. 143:157-161

10. Lewis J. y Vin J. (2007) . J. Anal. Tox. 31:195-199

11. DeClerck l. y Daenens P. (1997) . The Analyst 122:1119-1124

12. Huynh K. et al. SOFT 2009, October 19-23 2009, Oklahoma, Program and Abstracts

13. Lamont J.V. (2009) , Animal meeting of the AACC Clinical Chemistr y , vol. 55, nº 6, Suppl. S, página A250.

Compendio de la invención No existe ningún inmunoensayo pata la detección y determinación de zolpidem en muestras in vitro de pacientes que tenga una ventana de detección extendida. La presente invención proporciona una disolución a este problema. La invención emplea un anticuerpo único y de gran sensibilidad que se une al zolpidem y a su metabolito principal, el ácido 4-[3- (2-N, N dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico. La identificación del ácido 4- (3 (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico por el anticuerpo de gran sensibilidad de la invención permite métodos y kits para detectar e identificar el zolpidem que poseen una ventana de detección más amplia en comparación con otros inmunoensayos. Estos métodos y kits pueden utilizarse, por ejemplo, en casos de detección toxicológica y de violación facilitada por fármacos.

Dibujos Figura 1 Síntesis de hapteno I

Figura 2 Síntesis de hapteno II

Figura 3 Curvas de concentración-respuesta de anticuerpos para el zolpidem, su metabolito principal y analitos relacionados estructuralmente.

Exposición detallada de la invención Un primer aspecto de la invención es un inmunógeno de la estructura Estructura I

** (Ver fórmula) **

Estructura I

Donde -X-Y-Z es un agente de reticulación, n=0 ó 1 y accm es un material portador que confiere antigenicidad. En caso de estar presente, el agente de reticulación une el grupo carbonilo del anillo fenilo al accm. X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o un resto alquileno de C1-C10, más preferiblemente de C2-C6, de cadena lineal, sustituido o sin sustituir; Z (antes de la conjugación con el accm) se selecciona a partir de un resto carboxi, un ditiopiridilo, una maleimida, un amino, un hidroxiio, un tiol, un tioéster o un aldehído, más preferiblemente un resto carboxi. El inmunógeno preferido de la invención es cuando n=0. El accm puede ser cualquier material que haga que todo o parte del hapteno sea susceptible a la identificación del anticuerpo y la unión. Por ejemplo, el accm puede ser una proteína, un fragmento de proteína, un polipéptido sintético o un polipéptido semisintético. El anticuerpo puede ser un anticuerpo bmonoclonal, pero es preferiblemente un anticuerpo policlonal.

Un segundo aspecto de la invención es un anticuerpo frente a un inmunógeno de estructura I, que es capaz de unirse a un epítopo de zolpidem y a un epítopo del ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo (1, 2a]piridina-2-il] benzoico. El anticuerpo es preferiblemente específico para zolpidem y presenta una reactividad cruzada para el ácido 4-[3 (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil]) -6-metilimidazo (1, 2-a]piridina-2-il] benzoico. Cuando se

utiliza haciendo referencia a un anticuerpo, la palabra específica en el contexto de la presente invención se refiere al analito que está unido preferentemente por el anticuerpo, según... [Seguir leyendo]

1. Un inmunógeno de la estructura

** (Ver fórmula) **

en donde

accm es un material transportador que confiere antigenicidad; n= 0 ó 1; X es un heteroátomo, preferiblemente nitrógeno, oxígeno o azufre; Y es un resto arileno o alquileno de cadena lineal, sustituido o sin sustituir, de C1-10, preferiblemente de C2-6; Z es, antes de la conjugación con el accm, carboxi, ditiopiridilo, maleimida, amino, hidroxílo, tiol, tioéster o un resto aldehído.

2. Un anticuerpo generado contra un inmunógeno de la reivindicación 1 que es específico para un epítopo de zolpidem y que presenta reactividad cruzada a un epítopo de ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamÃ?no-2-oxoetil) -6metilímidazo[1, 2-a]piridin-2-il] benzoico.

3.El anticuerpo de la reivindicación 2 cuya reactividad cruzada con el ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) ) -6metilimidazo[1, 2-a]piridina-2-il]benzoico es mayor que 5 %, preferiblemente mayor que 10 % y aún más preferiblemente mayor que 15%.

4. Un método de detección o identificación del zolpidem o del ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino 2-oxoetil) -6metilitnidazo[1, 2-a]piridin-2-il]benzoico en una disolución de una muestra in vitro tomada de un paciente; comprendiendo el método en poner en contacto la muestra con el anticuerpo de las reivindicaciones 2 o 3 con un conjugado, midiendo el conjugado y deduciendo a partir de un calibrador la presencia o cantidad de zolpidem o del ácido 4-[3- (2-N, N-dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2-a]piridin-2-il]benzoico.

5. Un kit para detectar o identificar el zolpidem o el ácido 4- (3- (2-N, N dimetilamino-2-oxoetil) -6-metilimidazo[1, 2a]piridin-2-il]benzoico que comprende un anticuerpo de las reivindicaciones 2 o 3.

6. El kit de la reivindicación 5 que también comprende un conjugado y/o un calibrador.

7. El anticuerpo descrito en cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, que es un anticuerpo policlonal.