Identificación de linfocitos T reguladores mediante el regulador del gen global SatB1.

Un procedimiento de detección de linfocitos T reguladores inestables en una población de linfocitos T reguladores que tiene el potencial de conversión en funcionalidad de linfocitos T efectores,

procedimiento que comprende detectar células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en la población de linfocitos T.

Identificación de linfocitos T reguladores mediante el regulador del gen global SatB1

La presente invención proporciona un procedimiento para la identificación de linfocitos T reguladores inestables basándose en los elevados niveles del regulador del gen global SATB1 en linfocitos T reguladores. La Invención también se refiere a un procedimiento que utiliza llgandos que se unen específicamente a SATB1 para Identificar linfocitos T reguladores inestables.

Antecedentes de la invención

Los linfocitos T reguladores (Treg) están Implicados en la auto-tolerancia, homeostasls ¡nmunltarla, prevención de la autolnmunidad y supresión de la inmunidad a patógenos o tumores (Sakaguchl, S. y col., Cell 133:775-787 (2008); Balkaid, Y., Nat. Rev. Immunol 7:875-888 (2007); Beyer, M, Schultze, J., Blood 1008:804-811 (2006)). El factor de transcripción de forkhead FOXP3 es esencial para el desarrollo y la función de Treg ya que las mutaciones en FOXP3 producen grave autolnmunidad en ratones y seres humanos (Hori, S. y col., Science 299:1057-1061 (2003); Fontenot, J.D y col., Nat. Immunol. 4:330-336 (2003); Khattrl, R. y col., Nat. Immunol. 4:337-342 (2003); Brunkow, M.E. y col., Nat. Genet. 27:68-73 (2001); Bennett, C.L. y col, Nat. Genet. 27:20-21 (2001); Wildin, R.S. y col, Nat. Genet. 27:18-20 (2001)). FOXP3 previene el compromiso del linaje de linfocitos T efectores (Tefector) (Zhou, L. y col, Nature 453:236-240 (2008)), además, los mecanismos moleculares subyacentes son todavía imprecisos.

Los Treg se caracterizan por su función supresora e Incapacidad para producir citocinas. Se requiere la expresión de FOXP3 para el establecimiento y mantenimiento del linaje, Identidad y función supresora de T^g (Hori, S. y col, Science 299:1057-1061 (2003); Fontenot, J.D y col, Nat. Immunol. 4:330-336 (2003); Khattri, R. y col, Nat. Immunol. 4:337-342 (2003); Lin, W. y col, Nat. Immunol. 8:359-368 (2007); Wan, Y.Y, Flavell, R.A, Nature 445:766-770 (2007); Lahl, K. y col, J. Immunol. ¡n press (2009); Williams, L. M, Rudensky, A.Y, Nat. Immunol. 8:277-284 (2007)). La pérdida de FOXP3 en Treg se ha asociado a un fenotipo TH2 (Lin, W. y col, Nat. Immunol. 8:359-368 (2007); Wan, Y.Y, Flavell, R.A, Nature 445:766-770 (2007); Lahl, K. y col, J. Immunol. in press (2009)) respectivamente TH1 (Lin, W. y col, Nat. Immunol. 8:359-368 (2007)) o TH17 (Gavin, M.A. y col, Nature 445:771-775 (2007)) de Treg que sugiere que FOXP3 suprime activamente la diferenciación de Treg en Tefector- Un mecanismo de represión de la diferenciación de Tefector por FOXP3 podría ser la modulación directa de factores de transcripción (Ziegler, S.F, Annu. Rev. Immunol. 24:209-226 (2006)), tales como el factor 4 regulador de interferón (IRF4), que es necesario para la supresión mediada por Treg de la diferenciación de células efectoras TH2 (Zheng, Y. y col, Nature (2009)). Se ha sugerido el control epigenético por metilación de ADN o modificación de histonas como un mecanismo alternativo que sostiene el fenotipo y función de Treg (Wei, G. y col, Immunity 30:155-167 (2009)). Estos hallazgos novedosos indican que hay un grado significativo de plasticidad entre linajes de Tefector y Treg y que los mecanismos reguladores activos deben permitir Treg comprometidos para prevenir la diferenciación de Tefector. La presente invención proporciona novedosos genes marcadores para la identificación y caracterización específica de linfocitos T supresores humanos y/o reguladores que incluyen linfocitos T CD4+CD25+FOXP3+ naturales, adaptativos y ampliados en individuos sanos, además de pacientes con tumor o pacientes con enfermedades autoinmunitarias.

Pfoertner y col. (GenomeBiology 2006, 7:R54) describe la firma genética de linfocitos T reguladores.

Breve descripción de la invención

Se ha encontrado ahora que la enzima remodeladora de cromatina SATB1 (SEC ID N°: 2) que se requiere para el desarrollo normal de linfocitos T tímicos (Alvarez, J.D. y col. Genes Dev. 14:521-535 (2000)), homeostasis de linfocitos T periféricos (Nie, H. y col, J. Immunol. 174:4745-4752 (2005)), polarización de TH1/TH2 (Cai, S. y col. Nat. Genet. 38:1278-1288 (2006); Lund, R. y col, Eur. J. Immunol. 35:3307-3319 (2005)) y reprogramación de la expresión génica (Han, H.J. y col, Nature 452:187-193 (2008)) es un gen diana importante de FOXP3. La expresión de SATB1 es significativamente reducida en Treg de FOXP3+ murinos y humanos naturales e inducidos. FOXP3 reduce la expresión de SATB1 directamente como un represor transcripcional en el sitio de SATB1 e indirectamente mediante la inducción de microARN miR-155, miR-21, miR-7, miR-34 y miR-18a, uniéndose específicamente a la 3'UTR del ARNm de SATB1. La expresión reducida de SATB1 en células FOXP3+ alcanzada tanto por la expresión en exceso como la inducción de FOXP3 está ligada a la reducción significativa en citocinas TH1 y TH2. La pérdida de función de FOXP3 tanto por inactivación como mutación genética conduce a una regulación por incremento significativa de SATB1 y la posterior liberación de citocinas. Como el sitio de SATB1 está similarmente desmetilado en Treg y Tefector, el compromiso del linaje de T,eg requiere la inhibición activa y continua mediada por FOXP3 de SATB1, prohibiendo así la diferenciación de Tefector- Esto da importancia a la modulación específica de linfocitos T mediada por SATB1 de la remodelación de cromatina global durante el proceso de decisiones entre la función de linfocitos T efectores y reguladores. Y, lo que es más importante, la expresión en exceso de SATB1 en linfocitos Treg naturales humanos conduce a pérdida de función supresora y aumento de la función de Tefector en linfocitos Treg. Estos datos sugieren fuertemente que la inhibición de la modulación específica de linfocitos T mediada por SATB1 de la remodelación de cromatina global es centralmente

importante para el control de plasticidad funcional en linfocitos Treg. Así, la invención proporciona

1. Un procedimiento de detección de linfocitos T reguladores inestables en una población de linfocitos T reguladores que tienen el potencial de convertir en funcionalidad de linfocitos T efectores, procedimiento que comprende detectar células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en la población de linfocitos T.

2. El procedimiento de la claúsula 1, en el que las células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en la población de linfocitos T se detectan mediante un procedimiento que comprende

(a) poner en contacto la población de células con uno o más ligandos que se unen específicamente a SATB1, y

(b) identificar los linfocitos T reguladores en la población de células debido a una reducción significativa de la unión con los ligandos de unión a SATB1 en comparación con la unión de dichos ligandos con las otras células en la población de células.

3. El procedimiento de la claúsula 1 ó 2, que es adecuado para el control de calidad de poblaciones de linfocitos T reguladores.

4. El procedimiento de la claúsula 2, en el que los ligandos son anticuerpos o fragmentos de los mismos, preferentemente los ligandos son anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.

5. El procedimiento de la claúsula 2 ó 4, en el que los ligandos/anticuerpos llevan restos funcionales que Incluyen, pero no se limitan a, marcas, colorantes y toxinas.

6. El procedimiento de la claúsula 2, 4 ó 5, en el que la población de células está seleccionada de cultivo celular, sangre completa y fracciones de sangre completa y/o la población de células comprende células de mamífero que incluyen células humanas.

7. El procedimiento de la claúsula 6, que comprende además poner en contacto la población de células humanas con uno o más ligandos que se unen específicamente a CD4, CD25 y/o CD127 sobre los linfocitos T.

8. El procedimiento de la claúsula 6 ó 7, que comprende además ensayar la expresión de FOXP3.

9. Uso del ligando, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la claúsula 2, 4 ó 5 para identificar linfocitos T reguladores inestables en una población de células.

Breve descripción de las figuras

Fia. 1: SATB1 se reaula por disminución en linfocitos T reguladores naturales humanos. Se purificaron linfocitos T reguladores (Treg) naturales CD4+CD25alto CD127bajo tanto por clasificación de FACS como de MACS (>95 % de pureza). Se usaron linfocitos T convencionales (Tconv) CD4+CD25" para la comparación. Se estudiaron al menos 4 donantes y se representa la media +/- DE; * p< 0,05. a: Expresión de ARNm de SATB1 (rojo) y FOXP3 (azul) como se evalúa por el análisis de micromatrices en un total de 48 condiciones experimentales (3-4 duplicados cada uno, véase la Tabla 1). Las condiciones individuales... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de linfocitos T reguladores inestables en una población de linfocitos T reguladores que tiene el potencial de conversión en funcionalidad de linfocitos T efectores, procedimiento que comprende detectar células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en la población de linfocitos T.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en

la población de linfocitos T son detectadas mediante un procedimiento que comprende

(a) poner en contacto la población de células con uno o más ligandos que se unen específicamente a SATB1, y

(b) identificar los linfocitos T reguladores en la población de células debido a una reducción significativa de la unión con los ligandos de unión a SATB1 en comparación con la unión de dichos ligandos con las otras células en la

población de células.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, que es adecuado para el control de calidad de poblaciones de linfocitos T reguladores.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que los ligandos son anticuerpos o fragmentos de los mismos, preferentemente los ligandos son anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.

5. El procedimiento de la reivindicación 2 ó 4, en el que los ligandos/anticuerpos llevan restos funcionales que incluyen,

pero no se limitan a, marcas, colorantes y toxinas.

6. El procedimiento de la reivindicación 2, 4 ó 5, en el que la población de células está seleccionada de cultivo celular, sangre completa y fracciones de sangre completa y/o la población de células comprende células de mamífero que incluyen células humanas.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además poner en contacto la población de células humanas

con uno o más ligandos que se unen específicamente a CD4, CD25 y/o CD127 sobre los linfocitos T.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 ó 7, que comprende además ensayar la expresión de FOXP3.

9. Uso del ligando, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la reivindicación 2, 4 ó 5 para identificar linfocitos T reguladores inestables en una población de células.