Formulación inmunogénica.

Formulación inmunogénica que confiere protección contra la infección o patología causada por el virus respiratorio sincicial,

que comprende una cepa recombinante atenuada de Mycobacterium en una concentración entre 104-109 bacterias, CARACTERIZADA por que la cepa recombinante atenuada de Mycobacterium expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus respiratorio sincicial seleccionada entre las proteínas N, M2 o F, en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable.

Formulación Inmunogénica CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona al área de la inmunología y está particularmente relacionada con una formulación inmunogénica para ser utilizada para preparar una vacuna contra el virus respiratorio sincicial (VRS) . Dicha formulación comprende al menos una cepa viva recombinante atenuada de Mycobacterium, preferentemente la cepa Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) , recombinante para una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de VRS, estabilizada en una solución tampón salina.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención consiste en una formulación inmunogénica que induce protección contra la infección causada por el virus respiratorio sincicial (VRS) y/o atenúa la patología causada por este virus en mamíferos. La formulación inmunogénica de la presente invención puede ser utilizada para preparar vacunas y contiene unidades formadoras de colonia (CFU) (por ejemplo entre 1x104-1x109 CFU por dosis) de cepas vivas recombinantes atenuadas de Mycobacterium, preferentemente la cepa Bacilo de Calmette-Guérin (BCG) que expresan de manera recombinante o heteróloga una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de VRS, y que se encuentran conservadas, previo a su uso, liofilizadas (conservadas en el rango de temperaturas entre 4º C y 25º C) o en una solución salina estabilizadora (conservadas en el rango de temperaturas entre -80º C y 4º C) . Por ejemplo, la formulación inmunogénica resuspendida en solución diluida Sauton SSI (125 μg MgSO4, 125 μg K2HPO4, 1 mg L-asparragina, 12, 5 μg citrato de amonio férrico, 18, 4 mg 85% glicerol, 0, 5 mg ácido cítrico, 1 ml de H2O para inyección) y conservada a 4º C, la formulación inmunogénica en PBS (137 mM NaCl; 2, 7 mM KCl; 4, 3 mM Na2HPO4; 1, 47 mM KH2PO4, pH 7, 4) suplementado con Tween 80 0, 02% y Glicerol 20% conservada a -80º C o la formulación inmunogénica resuspendida en una solución volumen:volumen de lactosa 25% y Medio Proskauer y Beck suplementado con glucosa y Tween 80 (PBGT: 0, 5 g asparragina; 5, 0 g fosfato monopotasio; 1, 5 g citrato de magnesio; 0, 5 g sulfato de potasio; 0, 5 ml Tween 80 y 10, 0 g glucosa por litro de agua destilada) liofilizada conservada en el rango de temperaturas entre 4º C y 25º C.

Las bacterias Mycobacterium recombinantes atenuadas de la formulación inmunogénica de la presente invención contienen uno o más genes que codifican para al menos una proteína, o fragmento inmunogénico de VRS del subtipos VRS A o VRS B o de ambos. Estas proteínas, o fragmentos inmunogénicos de VRS corresponden a las proteínas NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 (ORF1) , M2 (ORF2) , L, F o G de VRS y se encuentran insertos en el genoma bacteriano o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias, y su expresión está comandada por promotores endógenos o exógenos de BCG, constitutivos o inducibles. Estas proteínas, o fragmentos inmunogénicos de VRS pueden ser expresados por BCG u otras cepas atenuadas de Mycobacterium, de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a la membrana celular.

La formulación inmunogénica que se divulga en la presente invención puede ser utilizada en conjunto con formulaciones inmunogénicas que contienen otras cepas atenuadas de Mycobacterium o BCG y que difieren en las proteínas inmunogénicas de VRS que expresan, así como en la ubicación de los genes (inserta en el genoma o extracromosomal) , el número de copias del gen de la proteína, el promotor que induce la expresión de la proteína, o la destinación de la proteína o fragmentos inmunogénicos de VRS (soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o proteínas unidas a membrana celular) .

Las bacterias Mycobacterium atenuadas de la formulación inmunogénica anteriormente descrita provienen de un cultivo de bacteria Mycobacterium en fase de crecimiento exponencial o estacionario, correspondiendo a densidad óptica a 600 nm entre 0, 5 y 1, 5, en solución salina tampón (PBS-Tween 80 0, 02%, o Solución diluida Sauton SSI) .

La formulación inmunogénica anteriormente descrita puede ser aplicada al individuo de forma subcutánea, percutánea o subdérmica, en conjunto con una solución salina tampón o fisiológica, como por ejemplo Solución diluida Sauton SSI (125 μg MgSO4, 125 μg K2HPO4, 1 mg L-asparragina, 12, 5 μg citrato de amonio férrico, 18, 4 mg 85% glicerol, 0, 5 mg ácido cítrico, 1 ml de H2O para inyección) .

La formulación inmunogénica anteriormente descrita puede ser usada para vacunar a individuos que hayan o no tenido contacto previo con el virus respiratorio sincicial, con el fin de conferir protección contra el VRS.

Antecedentes de la invención El Virus Respiratorio Sincicial (VRS) es el principal agente causante de infecciones agudas del tracto respiratorio en lactantes de todo el mundo. Según la OMS, este virus infecta a 64 millones de personas anualmente, de los cuales

160.000 muere (www.who.int) . La infección por este virus provoca una amplia gama de cuadros clínicos, que pueden ser leves como rinitis o mucho más severos, como neumonías o bronquiolitis, observándose los cuadros más graves en niños lactantes, prematuros, niños con cardiopatías congénitas y en inmunodeprimidos.

La infección causada por este virus es sumamente frecuente y recurrente, ya que prácticamente el 100% de los niños mayores de tres años han presentado por lo menos un episodio de infección por VRS. Debido a que esta infección no deja una memoria inmunológica completa (Hall, C. B., E. E. Walsh, C. E. Long, and K. C. Schnabel. 1991. Immunity to and frequency of reinfection with respirator y syncytial virus. In J Infect Dis, Vol. 163, p. 693) las reinfecciones son frecuentes, disminuyendo su severidad a medida que aumenta la edad del paciente.

La situación de salud generada por la infección por VRS genera un alto impacto económico para los países afectados. Estudios realizados en países desarrollados estiman que el costo individual de esta infección es de sobre 3.000 euros, con un límite superior de hasta 8.400 euros.

El VRS es un virus RNA de hebra simple negativa no segmentada, con envoltura lipídica y perteneciente a la familia de los paramyxoviridae, género pneumovirus (Wertz, G. W., and R. M. Moudy. 2004. Antigenic and genetic variation in human respirator y syncytial virus. In Pediatr Infect Dis J, Vol. 23, p. S19) . El VRS posee un genoma de aproximadamente 15 kb, que codifica para un total de 11 proteínas. Cinco de estas proteínas poseen funciones estructurales, correspondiendo a las glicoproteínas de transmembrana F, G y SH, la proteína de nucleocápside N y la proteína de matriz M. Las otras cuatro proteínas, M2-1, M2-2, P y L, están involucradas en la replicación viral y transcripción. Las dos proteínas restantes, denominadas NS1 y NS2, no son estructurales y al parecer están involucradas en virulencia.

El VRS que infecta al humano posee diferentes cepas o subgrupos, siendo los subgrupos A y B aquellos que predominan en la población. La principal diferencia antigénica entre los subgrupos corresponde a la proteína G, que sólo conserva un 40-44% de los aminoácidos entre los distintos subgrupos (Sullender, W. M. 2000. Respirator y syncytial virus genetic and antigenic diversity. In Clin Microbiol Rev, Vol. 13, p. 1) .

La primera vacuna contra VRS fue probada en los años sesenta y consistió en el virus completo inactivado con formalina (RSV-FI) , que se administró intramuscularmente en presencia del adyuvante alum. A diferencia de lo esperado, esta inmunización produjo un cuadro respiratorio mucho más severo en los niños vacunados tras la infección por VRS, que llevó a la hospitalización del 80% de los vacunados y la muerte de dos de ellos. El cuadro respiratorio-pulmonar que presentaron los vacunados se caracterizó por una inusual infiltración de eosinófilos y neutrófilos, junto con un título alto de anticuerpos fijadores de complemento. Análisis de los tejidos pulmonares de niños vacunados con RSV-FI que murieron debido a la infección por VRS muestran el depósito de complemento, complejos inmunes y la presencia de eosinófilos en las regiones peribronquiales. Junto con esto, estudios en modelos animales demuestran que la vacunación con RSV-FI produce una respuesta inmune de tipo Th2, basada en linfocitos T CD4+, que posee las mismas características que aquella observada en animales que han sido inmunizados con la proteína G o que reciben los linfocitos T CD4+ específicos para esta glicoproteína previo a la infección con VRS. Por esta razón, para formular una vacuna eficaz y segura contra VRS ha sido necesario el estudio acabado de la respuesta inmune generada contra las diferentes proteínas... [Seguir leyendo]

1. Formulación inmunogénica que confiere protección contra la infección o patología causada por el virus respiratorio sincicial, que comprende una cepa recombinante atenuada de Mycobacterium en una concentración entr.

10. 109 bacterias, CARACTERIZADA por que la cepa recombinante atenuada de Mycobacterium expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus respiratorio sincicial seleccionada entre las proteínas N, M2

o F, en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable.

2. La formulación inmunogénica de acuerdo con cláusula 1, caracterizada por que la cepa recombinante atenuada de Mycobacterium es la cepa Bacilo de Calmette y Guerin.

3. La formulación inmunogénica de acuerdo con cláusula 1, caracterizada por que el virus respiratorio sincicial corresponde al subtipo A, B o a ambos subtipos.

4. La formulación inmunogénica de acuerdo con la cláusula 1, caracterizada por que al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus respiratorio está seleccionado del genoma del virus respiratorio sincicial.

5. La formulación inmunogénica de la cláusula 4, caracterizada por que dicha proteína o fragmento inmunogénico del virus respiratorio seleccionado del genoma del virus respiratorio sincicial se encuentran insertos en el genoma de Mycobacterium o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias, controlados por promotores endógenos

o exógenos de Mycobacterium, y en que dicha proteína o fragmento inmunogénico del virus respiratorio sincicial están expresados por la cepa de Mycobacterium en forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a membrana celular.

6. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, caracterizada dicha formulación se utiliza además en conjunto con otras formulaciones inmunogénicas, que difieren en la forma que expresan las proteínas o fragmentos inmunogénicos como soluble, soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o proteínas unidas a membrana celular.

7. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, caracterizada por que dicha formulación se utiliza además en conjunto con otras formulaciones inmunogénicas que difieren en el número de copias de los genes de las proteínas o fragmentos inmunogénicos del virus respiratorio sincicial, así como en el control de la expresión de las proteínas o fragmentos inmunogénicos del virus respiratorio sincicial, constitutivos o inducibles.

8. La formulación inmunogénica de la cláusula 1 caracterizada por que dicha formulación es estabilizada por congelamiento, liofilización o solución salina tampón para su conservación previa a su uso.

9. La formulación inmunogénica de la cláusula 1, para uso en la inducción de protección contra infecciones del virus respiratorio sincicial y/o la atenuación de la patologia causada por dicho virus en mamíferos.

10. Vacuna que comprende la formulación inmunologica de las cláusulas 1 a 9.