Expansión in vitro de células postparto usando microportadores.

Un procedimiento de cultivo de células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje que comprende:

proporcionar al menos una célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje aislable de tejido del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre;

proporcionar un medio de crecimiento celular para cultivar la célula derivada de tejido umbilical;

proporcionar al menos un microportador para la unión de la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el microportador es tanto: (i) un microportador sin proteína que tiene una superficie positivamente cargada; como (ii) un microportador recubierto con colágeno; y

poner en contacto la célula dependiente del anclaje con el microportador en presencia del medio de crecimiento en condiciones que permitan la unión y el crecimiento de la célula, en el que las condiciones que permiten la unión y el crecimiento de la célula al inicio del cultivo en microportador usan agitación constante, cultivando así la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el fenotipo de las células es CD10+, CD13+, CD31-, CD34-, CD44+, CD45-, CD73+, CD90+, CD117-, CD141-, PDGFr-α+, HLA-A+, HLA-B+, HLA-C+, HLA-DR-, HLA- DP- y HLA-DQ- y son fenotípicamente las mismas que las células cultivadas en cultivos estáticos para cada uno de los marcadores.

CAMPO

La invención se refiere generalmente al crecimiento y expansión de células de mamífero. En particular, la invención se refiere a procedimientos para el crecimiento y la expansión de células derivadas de tejido umbilical in vitro usando superficies o partículas, tales como partículas microportadoras, pellas o perlas.

ANTECEDENTES

Los productos de terapia celular comerciales se producen preferentemente en sistemas asépticos que están cerrados. Sin embargo, el crecimiento de muchos tipos de células usadas para producto de terapia celular comercial depende del anclaje.

Aunque los reactores de tanque agitado, matraces con agitación, matraces con agitación centrífuga, reactores de sustentación y similares son todos útiles para células que crecen en suspensión (por ejemplo, hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales, muchas células usadas para la tecnología de ADN recombinante y la mayoría de los cultivos de células de insecto), están más limitadas las opciones para cultivar y expandir las células dependientes del anclaje.

Incluidas entre las células dependientes del anclaje están muchas cepas de células diploides normales, además de la mayoría de los tipos primarios de células. Las opciones para la producción a gran escala de tales células incluyen botellas rotatorias, lechos de fibra, sistemas de fibra hueca, sistemas de cultivo de múltiples placas o de placas apiladas, CelICube y microportadores, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas.

Los procedimientos de cultivo celular basados en microportadores proporcionan muchas ventajas que incluyen facilidad de procesamiento aguas abajo en muchas aplicaciones. Los microportadores normalmente son de forma aproximadamente esférica, y pueden ser tanto macro- como micro-porosos, o sólidos. El uso de microportadores para la unión de células facilita el uso de reactores de tanque agitado y relacionados para el crecimiento de células dependientes del anclaje. Las células se unen a las mlcropartículas fácilmente suspensas. El requisito para la capacidad de suspensión limita los parámetros físicos de los propios microportadores. Así, los microportadores comúnmente tienen un diámetro medio en el Intervalo de 5 - 2 micrómetros. En algunas aplicaciones, los microportadores tipo sólido oscilan de aproximadamente 1 a aproximadamente 25 micrómetros mientras que las perlas microportadoras tipo poroso oscilan de aproximadamente 25 a aproximadamente 25 micrómetros. Estos Intervalos de tamaño permiten la selección de microportadores que son suficientemente grandes para acomodar muchas células dependientes del anclaje, aunque suficientemente pequeñas para formar suspensiones con propiedades adecuadas para su uso en reactores con agitación.

Tanto los tipos porosos como sólidos de portadores mlcropartlculados están comercialmente disponibles de proveedores. Ejemplos de microportadores comerclalmente disponibles Incluyen Cytodex 1® y Cytodex 3®, que son ambos microportadores basados en dextrano de GE Healthcare Life Sciences. Los microportadores porosos en el mercado Incluyen productos CYTOLINE, además de Cytopore® también de GE Healthcare Life Sciences. También están comerclalmente disponibles Blos¡lon®(NUNC) y Cultlspher® (Percell Biolytica).

Aunque para algunos tipos de células la morfología de las células cultivadas sobre superficies altamente curvas, tales como aquellas proporcionadas por microportadores, puede ser un problema, generalmente los microportadores proporcionan muchas ventajas en términos de crecimiento a gran escala, que incluye la facilidad de recogida de las células y la facilidad de separación de productos extracelulares útiles de las propias células. Existe la necesidad en la materia de un procedimiento eficaz y de alto rendimiento para cultivar y recoger células dependientes del anclaje tales como células postparto derivadas de cordón umbilical o placenta.

RESUMEN

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para el crecimiento y la expansión de células de mamífero. Se proporcionan procedimientos para el crecimiento y la expansión de células derivadas de tejido umbilical in vitro utilizando superficies tales como perlas microportadoras o perlas microportadoras porosas. Las células de mamífero son células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje.

La invención proporciona un procedimiento de cultivo de células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje que comprende proporcionar al menos una célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje aislable de tejido del cordón umbilical sustanclalmente libre de sangre, proporcionar un medio de crecimiento celular para cultivar la célula derivada de tejido umbilical, proporcionar al menos un mlcroportador para la unión de la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el mlcroportador es tanto: (i) un microportador sin proteína que tiene una superficie positivamente cargada; como (¡I) un mlcroportador recubierto con colágeno; y poner

en contacto la célula dependiente del anclaje con el microportador en presencia del medio de crecimiento en condiciones que permitan la unión y el crecimiento de la célula, en el que las condiciones que permiten la unión y el crecimiento de la célula al inicio del cultivo en microportador usan agitación constante, cultivando así la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el fenotipo de las células es CD1+, CD13+, CD31-, CD34-, CD44+, CD45-, CD73+, CD9+, CD117-, CD141-, PDGFr-a+, HLA-A+, HLA-B+, HLA-C+, HLA-DR-, HLA- DP- y HLA-DQ- y son fenotípicamente las mismas que las células cultivadas en cultivos estáticos para cada uno de los marcadores.

El microportador es un ejemplo de una partícula portadora. El microportador puede comprender materiales naturales o sintéticamente derivados. Ejemplos incluyen microportadores basados en colágeno, microportadores basados en dextrano o microportadores basados en celulosa, además de vidrio, cerámicas, polímeros o metales. El microportador puede estar libre de proteína o recubierto con colágeno. En otro aspecto, el microportador puede comprender, o estar recubierto con, compuestos que potencian la unión de la célula al microportador y potencian la liberación de la célula del microportador que incluyen, pero no se limitan a, pol¡(monoestearo¡lgl¡cérido-co-ác¡do succínico), poli-D,L-lactida-co-glicolida, hialuronato de sodio, colágeno, fibronectina, laminina, elastina, Usina, n- ¡sopropilacrilamida, vitronectina. Ejemplos adicionales incluyen microportadores que poseen una microcorriente, tal como microportadores con un par galvánico de partículas de cinc y cobre que producen bajos niveles de electricidad biológicamente relevante; o microportadores que son paramagnéticos, tales como microportadores de calcio-alginato paramagnéticos. En otro aspecto, el procedimiento proporciona una segunda célula tipo co-cultivada con las células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje.

El procedimiento de cultivo de células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje proporciona cultivar las células para producir al menos aproximadamente cinco duplicaciones de la población durante aproximadamente veinte días. El procedimiento de cultivo de células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje proporciona cultivar las células para producir al menos aproximadamente siete duplicaciones y media de la población durante aproximadamente veinte días.

Se desvelan composiciones que comprenden células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje cultivadas mediante los procedimientos que utilizan partículas portadoras, por ejemplo, partículas microportadoras o partículas microportadoras porosas, para la unión a las células. Las células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje son fenotípicamente las mismas que las células cultivadas en cultivos estáticos como se ha determinado para uno o más de los marcadores CD1, CD13, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD9, CD117, CD141, PDGFr-a, FILA-A, FILA-B, FILA-C, FILA-DR, FILA-DP y HLA-DQ. En otro aspecto, las células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje son fenotípicamente CD1+, CD13+, CD31-, CD34-, CD44+, CD45-, CD73+, CD9+, CD117-, CD141-, PDGFr-a+, HLA-A+, HLA-B+, HLA-C+, HLA-DR-, HLA-DP- y HLA-DQ-, La invención puede hacer uso de un biorreactor que comprende las células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje cultivadas sobre partículas portadoras. Se desvela una composición para terapia celular utilizando las células postparto dependientes del anclaje cultivadas sobre partículas portadoras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Visión general

1. Un procedimiento de cultivo de células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje que comprende:

proporcionar al menos una célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje aislable de tejido del cordón umbilical sustancialmente libre de sangre;

proporcionar un medio de crecimiento celular para cultivar la célula derivada de tejido umbilical; proporcionar al menos un microportador para la unión de la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el microportador es tanto: (i) un microportador sin proteína que tiene una superficie positivamente cargada; como (¡i) un microportador recubierto con colágeno; y

poner en contacto la célula dependiente del anclaje con el microportador en presencia del medio de crecimiento en condiciones que permitan la unión y el crecimiento de la célula, en el que las condiciones que permiten la unión y el crecimiento de la célula al inicio del cultivo en microportador usan agitación constante, cultivando así la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje, en el que el fenotipo de las células es CD1+, CD13+, CD31-, CD34-, CD44+, CD45-, CD73+, CD9+, CD117-, CD141-, PDGFr-a+, HLA-A+, HLA-B+, HLA-C+, HLA-DR-, HLA- DP- y HLA-DQ- y son fenotípicamente las mismas que las células cultivadas en cultivos estáticos para cada uno de los marcadores.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el microportador contiene un agente bioactivo que regula el crecimiento o función de la célula.

3. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que comprende además un segundo tipo de célula cocultivada con dichas células derivadas de tejido umbilical dependientes del anclaje.

4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el microportador comprende un material seleccionado del grupo que consiste en colágeno, dextrano, celulosa, vidrio, cerámica, metal, poliestireno, pol¡(monoestearo¡lglicérido-co-ácido succínico), poli-D,L-lactida-co-glicolida e hialuronato de sodio.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que el microportador está recubierto con poli(monoestearoilglicérido- co-ácido succínico), poli-D,L-lactida-co-glicolida, hialuronato de sodio, fibronectina, laminina, elastina, lisina, n- ¡sopropilacrilamida, vitronectina o colágeno.

6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el microportador comprende una superficie texturizada o recubierta con plasma.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el microportador posee una microcorriente o es paramagnético.

8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el microportador es un microportador poroso.

9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que produce al menos cinco duplicaciones de la población durante veinte días.

1. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el tiempo de duplicación para la población es inferior a 1 horas.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tiempo de duplicación para la población es inferior a 7 horas.

12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que condiciones que permiten la unión y crecimiento de la célula derivada de tejido umbilical dependiente del anclaje comprenden una temperatura de aproximadamente 37 °C.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que las condiciones comprenden además un matraz con agitación o biorreactor.

14. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente, en el que el medio de crecimiento celular comprende una concentración en suero del 7 % al 15 %.