Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII a partir de soluciones de proteínas.

Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre caracterizado por que están contenidos/as una fase sólida,

con la que se había acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa, y un substrato cromogénico, el factor VII, el factor VIII/VIIIa, el factor V/Va o unos activadores de plasminógeno, permitiendo el substrato cromogénico una determinación de la actividad de la proteasa a través de un aumento de la absorción, que es dependiente de la concentración y del tiempo, mediante una amidolisis del substrato.

Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII a partir de soluciones de proteínas Es objeto del invento un estuche para la determinación cualitativa y cuantitativa de la proteasa que activa al factor VII en unas complejas soluciones de proteínas tales como un plasma.

A partir de la solicitud de patente alemana 199 03 693.4 se conocen ya unos sistemas de ensayo y unos procedimientos para la detección cualitativa y cuantitativa de una proteasa, que activa al factor VII de coagulación dela sangre. Éstos comprenden unos procedimientos de ensayo cromogénicos, que se basan en la disociación de unos substratos peptídicos de bajo peso molecular marcados y en la determinación fotométrica de la extinción que aparece en este caso, en los que se aprovechan las propiedades biológicas de la mencionada proteasa. En este caso la proteasa o su proenzima pueden ser detectadas por el hecho de que ella a) tiene un efecto desactivador de los factores VIII/VIIIa o V/Va de coagulación de la sangre o b) tiene un efecto abreviador de los tiempos de coagulación de la sangre en ensayos globales de coagulación o c) tiene un efecto activador sobre los activadores del plasminógeno o d) tiene un efecto activador del FVII.

Sin embargo, la determinación de la actividad del activador del FVII conduce, en los casos de los procedimientos de determinación empleados hasta ahora, a unos resultados que son fiables solamente cuando la proteasa se presenta en el estado purificado o enriquecido, y ninguna influencia perturbadora de impurezas falsea los resultados de las mediciones. Especialmente unas mezclas muy complejas de proteínas tales como un plasma o unos líquidos tisulares, contienen ahora, no obstante, un gran número de proteínas, que impiden una determinación específica del activador del factor VII o que por lo menos pueden obstaculizarla. Además de ello, de acuerdo con el actual estado de los conocimientos. la proteasa se presenta en el plasma sobre todo en forma de una proenzima, de tal manera que es necesaria una activación para dar la proteasa activa con la finalidad de realizar la subsiguiente determinación de la actividad.

La proteasa que activa al factor VII es una proteína plasmática, que participa en la regulación de la hemóstasis, sobre todo mediante una cooperación en procesos de coagulación y fibrinólisis. Por lo tanto, la investigación de la función y de la actividad biológica de la proteasa presenta un alto interés. Así, por ejemplo, un contenido reducido de antígenos y/o una perturbación de la actividad biológica, causada por ejemplo por una mutación génica, podría indicar un riesgo aumentado de trombosis. Por lo tanto, se planteó la misión de desarrollar un procedimiento, que haga posible una determinación lo más sencilla y específica que sea posible de una o varias actividades biológicas de la proteasa que activa al factor VII. Puesto que la misión fisiológica de esta proteasa todavía no ha sido esclarecida, este método debería permitir en principio la determinación de varias actividades.

Por fin, se encontró que estos requisitos son satisfechos por medio de un procedimiento para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre en soluciones de proteínas, en el que

-la solución de proteínas que contiene la proteasa y/o su proenzima, es incubada con una fase sólida, con la

que se había acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa y -después de haber separado por lavado la fase sólida, la proteasa y/o su proenzima fijada (s) a ella es (son)

incubada (s) con unos reactivos, que permiten la determinación de su actividad.

Este procedimiento de determinación se puede usar de manera sorprendente no sólo con la proteasa en su forma activada. A pesar de que los resultados de las investigaciones realizadas hasta ahora permiten sacar la conclusión de que la proteasa circula en el plasma predominantemente en forma de una proenzima, y que por lo tanto era de esperar que ésta, después de una fijación a la fase sólida arriba mencionada, en primer lugar todavía tiene que ser activada para poder desarrollar después de ello sus actividades biológicas, se encontró por fin de manera sorprendente que no es necesaria una tal activación, sino que la proenzima fijada a la fase sólida a partir del plasma desarrolla su actividad biológica en la forma inmovilizada de igual manera que la enzima activa. De esta manera es superflua una etapa separada de activación y se hace posible una determinación muchísimo más rápida y más exenta de perturbaciones.

Una activación específica de la proenzima se puede hacer seguir sin embargo absolutamenre con el fin de asegurar que la proenzima fijada hubiera sido activada completamente.

Como fase sólida entran en cuestión las matrices conocidas para un experto en la especialidad tales como un Sepharose® o Fractogel® activado. De manera preferida, unas placas de microtitulación se revisten con unos 2 15

anticuerpos dirigidos contra la proteasa, que pueden ser de procedencia policlonal o monoclonal. También se pueden utilizar unos fragmentos de anticuerpos tales como un F (ab) o F (ab) 2. Al contrario que el ensayo con antígenos, en el que se utiliza un segundo anticuerpo marcado para la detección y luego también para la cuantificación, conforme al invento se añaden unos substratos cromogénicos, que permiten la determinación de la actividad de la proteasa. Un substrato cromogénico especialmente preferido es el S2288 de Chromogenix AB (H-Diso-leucil-L-prolil-L-arginina-pNA x 2 HCl) , que, al igual que unos compuestos similares, muestra un significativo aumento de la absorción, que es dependiente de la concentración y del tiempo, por medio de una amidolisis del substrato. Sorprendentemente, la proteasa conserva sus actividades biológicas y sus propiedades también después de una fijación a los anticuerpos, a saber la capacidad de activar al FVII y a los activadores del plasminógeno. De esta manera se hace posible la determinación específica de la funcionalidad de la proteasa a partir de una compleja solución de proteínas.

Junto a los substratos cromogénicos, también se proponen los demás substratos que se mencionan en la solicitud de patente alemana 199 03 693.4 para la determinación de una actividad, por lo tanto la desactivación de los factores VIII/VIIIa o V/Va de coagulación de la sangre y también la activación del FVII y de los activadores del plasminógeno. En este caso, por ejemplo, la proporción del factor VII que ha sido activada de esta manera puede ser determinada mediante una amidolisis directa de un substrato cromogénico específico para el FVII o mediante una reacción acoplada tal como el denominado ensayo de FVIIa-rTF. La activación de unos activadores del plasminógeno monocatenarios scuPA (acrónimo del inglés "single chain urokinase plasminogen activator" = activador del plasminógeno monocatenario del tipo de la urocinasa) o del sctPA (acrónimo del inglés " single chain tissue plasminogen activator" = activador tisular del plasminógeno monocatenario) se puede seguir fácilmente mediante la conversión química del substrato de, por ejemplo, el S2444 (piroGlu-Gly-Arg-pNA x HCl) . Tal como se describe en la solicitud de patente alemana 199 03 693.4, para la detección se pueden añadir también unas sustancias, que estimulan a la actividad de la proteasa, por ejemplo, unas sales solubles de calcio y/o heparina o unas sustancias emparentadas con la heparina, tales como un sulfato de dextrano.

Otras investigaciones de soluciones, líquidos corporales y extractos de células o respectivamente de tejidos, con ayuda del procedimiento descrito, mostraron su idoneidad para la detección o respectivamente cuantificación de la proteasa que activa al FVII. Por este concepto se han de entender también las soluciones que contienen esta proteasa, tales como compuestos intermedios de la preparación previa de la proteasa, materiales sobrenadantes de los cultvos de células que resultan también en el caso de la fermentación de unas correspondientes células para la expresión recombinante. Por este concepto se han de entender también unas soluciones que resultan en el caso de la producción transgénica de la proteasa o respectivamente de la proenzima, tales como la leche.

Además de esto, el procedimiento se adecua para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al FVII en unos extractos de tejidos o células, que proporciona una impresión acerca de la presencia de la actividad de proteasa o respectivamente acerca de unos potenciales estados patológicos en el caso de una sobre-o infraexpresión de esta proteína.

Le corresponde un interés especial... [Seguir leyendo]

1. Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre caracterizado por que están contenidos/as una fase sólida, con la que se había acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa, y un substrato cromogénico, el factor VII, el factor VIII/VIIIa, el factor V/Va o unos activadores de plasminógeno, permitiendo el substrato cromogénico una determinación de la actividad de la proteasa a través de un aumento de la absorción, que es dependiente de la concentración y del tiempo, mediante una amidolisis del substrato.

2. Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado por que el anticuerpo dirigido contra la proteasa es un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento de anticuerpo F (ab) o F (ab) 2.

3. Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de acuerdo con las reivindicaciones 1 hasta 2 caracterizado por que está contenida adicionalmente una sustancia que estimula a la actividad de la proteasa.

4. Estuche para la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado por que las sustancias que estimulan a la proteasa son unas sales solubles de calcio y/o heparina o unas sustancias emparentadas con la heparina tales como sulfato de dextrano.

5. Procedimiento para el reconocimiento precoz de un infarto o de una angina de pecho estable o inestable, caracterizado por que en una muestra de un líquido corporal se determina una actividad significativamente aumentada de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre en comparación con un colectivo de donantes sanos, efectuándose la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre mediante el recurso de que

- la muestra de un líquido corporal, que contiene la proteasa y/o su proenzima, se incuba con una fase sólida, con la que anteriormente se había acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteasa y -después de la separación por lavado de la fase sólida, se incuba (n) la proteasa fijada a ella y/o su proenzima con unos reactivos, que permiten la determinación de su actividad.

6. Procedimiento para el reconocimiento precoz de un infarto o de una angina de pecho estable o inestable de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado por que se determina un contenido de un antígeno, aumentado significativamente, de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre.

7. Procedimiento para el diagnóstico de la evolución y/o del grado de gravedad de un infarto y/o del éxito de una profilaxis y/o de una terapia en el caso de una angina de pecho, caracterizado por que en una muestra de un líquido corporal se determina la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre, y la magnitud de los valores medidos proporciona unas indicaciones acerca del estado del paciente, efectuándose la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII mediante el recurso de que,

- la muestra de un líquido corporal que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, con la que previamente se había acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteasa y -después de la separación por lavado de la fase sólida, se incuba (n) la proteasa fijada a ella y/o su proenzima con unos reactivos, que permiten la determinación de su actividad.

8. Procedimiento para la vigilancia de un embarazo, caracterizado por que en el transcurso del embarazo se determina un aumento de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre, efectuándose la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre en diversas épocas del embarazo mediante el recurso de que

- la muestra de un líquido corporal que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, con la que previamente se había acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteasa y -después de la separación por lavado de la fase sólida, se incuba (n) la proteasa fijada a ella y/o su proenzima con unos reactivos, que permiten la determinación de su actividad.

9. Procedimiento para la vigilancia de un embarazo de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizado además por que se determina un aumento moderado del contenido de antígeno de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre.

10. Procedimiento para el reconocimiento precoz de un riesgo de trombosis, caracterizado por que en una muestra de un líquido corporal se determina una actividad disminuida en comparación con el promedio de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre, efectuándose la determinación de la actividad de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre en diversas épocas del embarazo mediante el recurso de que

- la muestra de un líquido corporal que contiene la proteasa y/o su proenzima se incuba con una fase sólida, con la que anteriormente se había acoplado un anticuerpo dirigido contra la proteasa y -después de la separación por lavado de la fase sólida, se incuba (n) la proteasa fijada a ella y/o su proenzima con unos reactivos, que permiten la determinación de su actividad.

11. Procedimiento para el reconocimiento precoz de un riesgo de trombosis de acuerdo con la reivindicación 10 caracterizado además por que se determina un contenido disminuido o normal del antígeno de la proteasa que activa al factor VII de coagulación de la sangre.