Determinación de la sensibilidad de una célula a un fármaco.

Un método in vitro para determinar la resistencia o sensibilidad de una línea de células o muestra de un paciente a un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas,

en donde el método comprende los pasos de:

(i) tratar una muestra de paciente o línea de células, o una porción de la misma, con un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas;

(ii) lisar las células de la muestra de paciente o línea de células procedente del paso (i);

(iii) mezclar una porción del lisado de células de (ii) con (a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa, y (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas;

(iv) mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con (a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa, (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas y (c) un agente de desfosforilación;

(v) opcionalmente, mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica desoxirribonucleósido-quinasa; y

(vi) medir la bioluminiscencia de cada una de las mezclas de los pasos (iii), (iv) y opcionalmente (v), en donde los niveles comparativos de bioluminiscencia de cada una de las mezclas proporcionan una medida de la resistencia o sensibilidad al fármaco,

en donde (a), (b) y (c) son tres componentes separados.

Determinación de la sensibilidad de una célula a un fármaco.

Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y kits para determinar la sensibilidad de células a fármacos análogos de nucleósidos.

Antecedentes de la Invención La leucemia mieloide aguda (AML) es un término utilizado para definir un grupo heterogéneo de trastornos hematológicos resultantes de la transformación maligna de células precursoras mieloides. La transformación conduce a la proliferación de células inmaduras e indiferenciadas en la sangre y la médula ósea, y la supresión de la hematopoyesis normal. El tratamiento eficaz de los pacientes de AML es desafiante, y el resultado clínico puede ser decepcionante e impredecible. Sólo el 70% de los pacientes de nuevo diagnóstico que reciben regímenes estándar responden al tratamiento. Adicionalmente, una gran proporción de estos pacientes no logran la remisión a largo plazo y desarrollan resistencia a la terapia subsiguiente.

Los análogos de nucleósidos (NA) son una clase de fármaco antimetabolitos utilizada ampliamente en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer e infecciones virales. Estos compuestos se asemejan estructuralmente a los nucleósidos naturales del cuerpo y están sujetos a los mismos mecanismos fisiológicos de absorción y metabólicos, lo cual da como resultado su incorporación en el DNA de nueva síntesis. Esta adulteración del DNA da como resultado la inhibición de la síntesis de DNA y la terminación de cadenas, conduciendo a la muerte celular. Los NA son profármacos que requieren fosforilación a trifosfatos para formar el nucleótido activo. Ciertos NA no interrumpen directamente la replicación del DNA. Por ejemplo, el fármaco anti-herpes aciclovir, después de la absorción celular y fosforilación, interrumpe la replicación del DNA por inhibición de la DNA-polimerasa.

El análogo de nucleósido Ara-C es uno de los agentes anticáncer simples más activos y ha sido el tratamiento principal de la AML durante más de tres décadas. In vivo, Ara-C es transportado a la célula por el transportador específico de nucleósidos hENT1 y es fosforilado rápidamente por dCK a su forma monofosfato. Ara-CMP es fosforilado ulteriormente por las nucleósido-quinasas a su forma activa tri-fosforilada, Ara-CTP. Los efectos antiproliferativos y citotóxicos de Ara-CTP son debidos a su capacidad para interferir con la DNA-polimerasa e incorporarse en las cadenas de DNA conduciendo a la terminación de cadena y detención de la síntesis del DNA. Ara-C a dosis altas puede causar también acumulación de citocromo C en el citosol, pérdida de potencial de membrana mitocondrial y aumento de especies químicas de oxígeno reactivas.

La quimiorresistencia a Ara-C puede surgir por varios factores que influyen en la velocidad de formación de Ara-CTP y la incorporación en el DNA, incluyendo absorción baja del fármaco, conversión en Ara-U por la citidinadesaminasa, o desfosforilación del metabolito activo por las nucleotidasas citoplásmicas.

El mecanismo primario de resistencia a los fármacos análogos de nucleósidos es debido a insuficiente NA-trifosfato. Las causas principales de esto son niveles disminuidos de enzimas fosforilantes (v.g. dCK) , absorción celular ineficiente (v.g. niveles disminuidos de hENT1) , niveles incrementados de enzimas degradantes del NA (particularmente citidina-desaminasa, cdd, y expansión de agrupaciones de desoxirribonucleótido-trifosfatos (dNTP) . Se considera también que los niveles de desoxirribonucleósido-quinasa (dNK) juegan un papel clave en la resistencia a los fármacos.

Ara-C no tiene efecto alguno sobre Escherichia coli dado que carece de dCK y desamina Ara-C a Ara-uracilo debido a la actividad de la desoxicitidina-desaminasa (cdd) . Wang et al., Antimicrob. Agents. Chemother., 1998, 42:26202625, describieron la construcción de un mutante de E. coli deficiente en cdd (SØ5218) que, después de la expresión del gen de dCK humana, exhibía un crecimiento relativo reducido en presencia de Ara-C. El efecto de Ara-C sobre el crecimiento era completamente anulado cuando se ensayaba en ausencia del promotor inducible de dCK, IPTG, lo que indicaba que la expresión de dCK humana en la bacteria conduce a la incorporación de Ara-CTP en el DNA bacteriano.

Adicionalmente, Smith et al. (Blood, vol 106, No. 11, parte 1, 2005, página 695A) describen un método para determinación de la sensibilidad de las células a Ara-C, que comprende: administrar Ara-C a las células AML y lisar las células; poner en contacto el lisado de células con una cepa de E. coli deficiente en cdd que lleva el operón luxABCDE y que expresa la desoxicitidina-quinasa humana bajo el control del promotor lac, inducible por IPTG; y medir la bioluminiscencia y compararla con la bioluminiscencia de controles sin tratar.

La evaluación in vitro de la eficacia de Ara-C ha implicado tradicionalmente medida de a) la muerte celular, b) la reducción de la actividad en fase S o c) el uso de ensayos clonogénicos de AML después de la exposición de las células leucémicas a Ara-C. Estos métodos no están estandarizados, consumen mucho tiempo, son caros y no son adecuados para cribado de rutina. Por esta razón, los pacientes se tratan con regímenes que incluyen Ara-C con indiferencia de su sensibilidad al fármaco y pueden sufrir efectos laterales debilitantes tales como mielosupresión, náusea, diarrea, vómitos y el desarrollo de cánceres secundarios resistentes al fármaco.

Así pues, existe necesidad de un test de pre-cribado simple y rápido para determinación de la eficacia de los fármacos análogos de nucleósidos en pacientes.

Sumario de la Invención La presente invención está dirigida a métodos y kits para determinación de la resistencia o sensibilidad de las células a fármacos dependientes de desoxirribonucleósido-quinasas.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, un método in vitro para determinación de la resistencia de o sensibilidad de una línea de células o muestra de paciente a un fármaco dependiente de desoxirribonucleósidoquinasas comprende los pasos de:

(i) tratar una muestra de paciente o línea de células , o una porción de la misma, con un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas;

(ii) lisar las células de la muestra de paciente o línea de células procedente del paso (i) ;

(iii) mezclar una porción del lisado de células de (ii) con (a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa, y (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasa;

(iv) mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa, (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas y (c) un agente de desfosforilación;

(v) opcionalmente, mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica desoxirribonucleósido-quinasa; y

(vi) medir la bioluminiscencia de cada una de las mezclas de los pasos (iii) , (iv) y opcionalmente (v) , en donde los niveles comparativos de bioluminiscencia de cada una de las mezclas proporcionan una medida de la resistencia o sensibilidad al fármaco,

en donde (a) , (b) y (c) son tres componentes separados.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, un kit para determinación de la resistencia o sensibilidad de una línea de células o muestra de paciente a un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas comprende

(a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa, (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósidoquinasas y (c) un agente de desfosforilación, en donde (a) , (b) y (c) son tres componentes separados. La bacteria informadora bioluminiscente es preferiblemente una cepa deficiente en desoxicitidina-desaminasa (cdd) , preferiblemente una cepa de E. coli MG 1655 deficiente en cdd. La bacteria informadora bioluminiscente expresa preferiblemente el operón luxCDABE, y la bacteria informadora bioluminiscente es preferiblemente la cepa depositada como No. de Acceso NCTC 13427. La desoxirribonucleósido-quinasa es preferiblemente desoxicitidinaquinasa. El agente de desfosforilación es preferiblemente fosfatasa alcalina bacteriana. El promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasa... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la resistencia o sensibilidad de una línea de células o muestra de un paciente a un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas, en donde el método comprende los pasos de:

(i) tratar una muestra de paciente o línea de células, o una porción de la misma, con un fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas;

(ii) lisar las células de la muestra de paciente o línea de células procedente del paso (i) ;

(iii) mezclar una porción del lisado de células de (ii) con (a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósidoquinasa, y (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas;

(iv) mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con (a) una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósidoquinasa, (b) un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas y (c) un agente de desfosforilación;

(v) opcionalmente, mezclar una porción del lisado de células del paso (ii) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a los fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica desoxirribonucleósido-quinasa; y

(vi) medir la bioluminiscencia de cada una de las mezclas de los pasos (iii) , (iv) y opcionalmente (v) , en donde los niveles comparativos de bioluminiscencia de cada una de las mezclas proporcionan una medida de la resistencia o sensibilidad al fármaco,

en donde (a) , (b) y (c) son tres componentes separados.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente los pasos de:

a) someter células sin tratar de la muestra de paciente o línea de células a lisis;

b) mezclar una porción del lisado de células del paso (a) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa y un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas;

c) mezclar una porción del lisado de células del paso (a) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica una desoxirribonucleósido-quinasa y un promotor de la transcripción de desoxirribonucleósido-quinasas y un agente de desfosforilación;

d) opcionalmente, mezclar una porción del lisado de células del paso (a) con una bacteria informadora bioluminiscente que es sensible a fármacos análogos de nucleósidos e incorpora un gen que codifica desoxirribonucleósido-quinasa; y

e) medir la bioluminiscencia de cada una de las mezclas de los pasos (b) , (c) y opcionalmente (d) , y sustraer cada valor del valor de bioluminiscencia correspondiente medido en los pasos (iii) , (iv) y opcionalmente (v) respectivamente de la reivindicación 1, en donde la comparación de los valores resultantes para la bioluminiscencia de cada ensayo proporciona una medida de resistencia o sensibilidad al fármaco,

preferiblemente en donde el paso (v) de la reivindicación 1 no se lleva a cabo y en donde (a) la resistencia de una línea de células o muestra de paciente se clasifica por aplicación de la fórmula general siguiente:

cuando la bioluminiscencia de [T (n) - C (n) ] ~ [T (m) - C (m) ], la muestra de paciente o línea de células es resistente al fármaco,

o en donde (b) la resistencia de la línea de células o muestra de paciente al fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas se clasifica por aplicación de la fórmula siguiente:

% Int = [T (n/m) - C (n/m) ] x 100

en donde n = LIP y m = LI,

y en donde la muestra de paciente o línea de células es sustancialmente resistente al fármaco si % Int =< 10%,

cuando % Int = % interacción, T = tratamiento (fármaco) ; C = control (sin fármaco) , LI = lisado y promotor de transcripción, LIP = lisado y promotor de transcripción y fosfatasa.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el paso (v) de la reivindicación 1 se lleva a cabo y en donde la resistencia o sensibilidad de una línea de células o muestra de paciente se clasifica por aplicación de la fórmula general siguiente:

cuando la bioluminiscencia de LIP>LI and LIP>L and LI≈L, las células absorben y metabolizan el fármaco; cuando la bioluminiscencia de LIP>L and LI>L and LIP≈LI, el fármaco es absorbido pero no metabolizado; cuando la bioluminiscencia de LIP>LI>L, el fármaco es absorbido y parcialmente metabolizado; y cuando la bioluminiscencia de LIP≈LI≈L, el fármaco no es absorbido, donde L = lisado, LI = lisado y promotor de

transcripción, LIP = lisado y promotor de transcripción y fosfatasa.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se lleva a cabo el paso (v) de la reivindicación 1 y en donde la sensibilidad de una línea de células o muestra de paciente se clasifica por aplicación de la fórmula siguiente:

% Int = [T (n/m) ] x 100 en donde % Int = % de interacción, T = tratamiento (fármaco) y: n=LIP y m=LI; o n=LIP y m=L; o n=LI y m=L, en donde la muestra de paciente o línea de células absorbe y metaboliza el fármaco dependiente de desoxirribonucleósido

quinasas si % lnt=>10% cuando n=LIP, m=Ll and % lnt <10% cuando n=LI, m=L;

la muestra de paciente o línea de células absorbe y no metaboliza el fármaco dependiente de desoxirribonucleósidoquinasas si % lnt=<10% cuando n=LIP, m=Ll and % lnt>10% cuando a la vez n=Ll, m=L, y n=LIP, m=L; la muestra de paciente o línea de células absorbe y metaboliza parcialmente el fármaco dependiente de desoxirribo

nucleósido-quinasas si % lnt=>10% cuando n=LIP, m=LI y % Int>10% cuando n=LI, m=L; y la muestra de paciente o línea de células no absorbe el fármaco dependiente de desoxirribonucleósido-quinasas si % lnt =<10% cuando n=LIP, m=LI y n=LI, m=L y n=LIP, m=L.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde se lleva a cabo el paso (v) de la reivindicación 1 y en donde la resistencia o sensibilidad de una línea de células o muestra de paciente se clasifica por aplicación de la fórmula siguiente:

% Int =