Detección de a-fucosilación en anticuerpos.

Método para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpo glucosilado o de un fragmento del mismo,

que comprende:

a) eliminación enzimática de residuos sacáridos heterogéneos de la proteína, b) eliminación enzimática de otros residuos heterogéneos de la proteína, c) posterior análisis de la proteína,

en el que la eliminación en la etapa a) se lleva a cabo con Endo S y Endo H.

Detección de a-fucosilación en anticuerpos

La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpo glucosilado o un fragmento del mismo.

Antecedentes

Aunque las regiones variables dentro de los dominios Fab (fragmentos de unión a antígeno) de los anticuerpos son responsables del reconocimiento del antígeno, la región Fe (fragmento cristalizable) representa una parte invariante del anticuerpo que es responsable de la mediación de las funciones efectoras. En el caso de la inmunoglobulina G (IgG), entre estas se incluyen la fijación del complemento y la unión a receptores de Fcy (FcyR). La presencia de un oligosacárido unido a N en un único sitio conservado (Asn297) dentro del dominio CH2 del fragmento Fe homodimérico es obligatoria para la mediación de estas dos funciones efectoras. Se ha descubierto sólo recientemente que la modificación de los carbohidratos unidos también puede presentar un efecto de mejora de la afinidad para la interacción entre FcyR Illa e IgG. La modificación de carbohidrato responsable de dicho efecto es la ausencia de un residuo de fucosa que habitualmente se encuentra unido al primer residuo N-acetilglucosamina (GIcNAc) en el glicano complejo biantenario de IgG (figura 1).

Ha podido demostrarse en experimentos in vivo e in vitro que dicha afinidad incrementada resulta en una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) incrementada, mediada principalmente por células asesinas naturales (NK). En consecuencia, también se cree que dichos anticuerpos a-fucosilados presentan una eficacia mejorada en tratamientos destinados a erradicar las células opsonizadas.

La generación de anticuerpos a-fucosilados representa un importante reto biotecnológico que puede conseguirse mediante varios métodos. Aunque las líneas celulares con eliminación completa de los enzimas participantes en la biosíntesis de la fucosilación (por ejemplo mediante inactivación génica) pueden rendir anticuerpos cuantitativamente a-fucosilados, la mayoría de los demás métodos no pueden. Por ejemplo, el tratamiento con ARNip o el cocultivo de células expresantes de anticuerpos con kifunensina (Zhou et al., Biotechnol. Bioeng. 99:652- 665, 28), así como la modificación de los carbohidratos por la N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-lll), que estimula la formación de oligosacáridos bisectados, inhibiendo en consecuencia la reacción de fucosilación (Umana ef al., Nat. Biotech. 17:176-18, 1999), conduce a anticuerpos sólo parcialmente a-fucosilados.

Estos anticuerpos parcialmente a-fucosilados pueden mostrar principalmente una distribución heterogénea de la a- fucosilación dentro de un grupo de anticuerpos. Por ejemplo, las tasas de fucosilación pueden ser diferentes durante la fermentación. Además, el suceso de fucosilación podría ser cooperativo, es decir, la segunda fucosilación en el anticuerpo homodimérico podría producirse a una tasa incrementada (cooperatividad positiva) o reducida (cooperatividad negativa) en comparación con la primera.

El complejo FcyRIIla/lgG presenta una estequiometría 1:1 pero IgG presenta dos sitios de unión para FcyRIIIa. En consecuencia, en un único anticuerpo a-fucosilado, el receptor puede unirse con elevada afinidad al sitio de unión formado por el glicano a-fucosilado de la IgG y el núcleo de la proteína o con baja afinidad al sitio de unión que consiste del carbohidrato fucosilado y el núcleo de la proteína. Por lo tanto, puede concluirse que un grupo de anticuerpos con una a-fucosilación de 5% podría consistir de una población homogénea de anticuerpos en la que únicamente uno de los dos N-glicanos se encuentra fucosilado, o 5% de anticuerpos en los que ambos N-glicanos se encuentran fucosilados mientras que en el otro 5% ninguno de los N-glicanos se encuentra fucosilado. Resulta evidente que esta división diferencial de la a-fucosilación influye sobre la afinidad global para FcyRIIIa y resulta en una actividad biológica diferente. Por lo tanto, resulta obligatorio analizar la actividad biológica de dicha preparación de anticuerpos de manera directa mediante la utilización de un sistema de ensayo biológico (bioensayo) o indirectamente mediante la medición bioquímica de la tasa y distribución de la a-fucosilación, lo que rinde un resultado más exacto.

La glucoanalítica actual del estado de la técnica utiliza la N-glucosidasa F (PNGasa F) de Flavobacterium meningosepticum para escindir los carbohidratos unidos a N con un análisis posterior de EM MALDI (espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz) (según Papac ef al., Glycobiology 8:445-454, 1998). El documento n° US 27/16636 muestra el análisis del estado de fucosilación de un anticuerpo mediante la digestión con PNGasa F y EndoH, que libera los oligosacáridos del polipéptido antes del análisis mediante EM. Sin embargo, mediante la utilización de dicho procedimiento se pierde la información de los enlaces y no resulta posible determinar la distribución de la fucosilación dentro de una preparación de anticuerpos.

Por otra parte, el análisis del anticuerpo completo utilizando EM-IEP (espectrometría de masas-ionización por electropulverización) rinde patrones de masas complejos que no permiten una interpretación cuantitativa debido a

las diversas modificaciones aparte de la fucosilación, como la galactosilación, la heterogeneidad de la lisina C- terminal, la desamldaclón, etc., que pueden producirse o no en ambas subunidades de la IgG homodimérica.

Por lo tanto, existe una necesidad de un nuevo método analítico que elimine la heterogeneidad mencionada pero que mantenga la información de los enlaces.

Descripción de la invención

Las desventajas anteriormente indicadas son superadas por la presente invención, que proporciona métodos para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpos glucosilado. Preferentemente, se determina la cantidad de residuos de fucosa y su patrón de distribución dentro de un anticuerpo o de un fragmento del mismo. El análisis de la distribución de residuos de fucosa por cada molécula de Fe en una preparación de anticuerpos también es parte de la presente invención. Además, la presente invención puede utilizarse para la determinación de fucosilación cooperativa en una preparación de anticuerpos durante la fermentación. Por lo tanto, la presente invención proporciona un método que llena un vacío en el análisis de los anticuerpos. Con el conocimiento de los patrones de fucosilación en un anticuerpo o fragmento del mismo obtenido mediante este nuevo método, ahora resulta posible una predicción más exacta de la potencia mediada por Fe.

Inesperadamente, los inventores de la presente invención han encontrado que Endo S (un enzima con actividad de endoglucosidasa, originalmente identificado en Streptococcus pyogenes (Collin y Olsen, EMBO J. 2:346-355, 21) corta las fracciones de glicano complejo de la región Fe de la IgG humana, dejando únicamente el primer residuo de GIcNAc al que puede unirse un residuo de fucosa. Los carbohidratos de tipo híbrido que son discriminados (no cortados) por Endo S pueden cortarse cuantitativamente en el mismo sitio por endoglucosidasa H (Endo H). La combinación de ambos enzimas permite de esta manera la preparación de una proteína uniformemente glucosilada que sólo varía por el contenido de fucosa. El análisis de dichos fragmentos de Fe tratados no sólo permite la determinación del contenido de fucosa sino también la determinación de la distribución de los residuos de fucosa dentro del grupo de anticuerpos analizado. Estos nuevos resultados cierran un vacío analítico y podrían permitir una estimación de la potencia del anticuerpo analizado en términos de su eficacia en la inducción de la ADCC.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a un método para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpo glucosilado o de un fragmento del mismo, que comprende las etapas siguientes:

a) eliminación enzimática de residuos sacáridos heterogéneos de la proteína,

b) eliminación enzimática de otros residuos heterogéneos de la proteína,

c) posterior análisis de la proteína,

en las que la eliminación en la etapa a) se lleva a cbo mediante Endo S y Endo H.

En una realización, la etapa c) de dicho método comprende además una etapa de purificación antes del análisis. En una realización específica, la purificación se consigue mediante cromatografía de afinidad o mediante cromatografía de exclusión por tamaño. La cromatografía de afinidad puede llevarse a cabo utilizando, por... [Seguir leyendo]

1. Método para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpo glucosilado o de un fragmento del mismo, que comprende:

a) eliminación enzimática de residuos sacáridos heterogéneos de la proteína, b) eliminación enzimática de otros residuos heterogéneos de la proteína, c) posterior análisis de la proteína, en el que la eliminación en la etapa a) se lleva a cabo con Endo S y Endo H.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa c) comprende además una etapa de purificación previa

al análisis.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se determina la cantidad de residuos de fucosa y su patrón de distribución entre moléculas dentro de una preparación de anticuerpos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se determina la distribución de residuos de fucosa por cada molécula de Fe en una preparación de anticuerpos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la eliminación en la etapa b) se lleva a cabo con plasmina y/o carboxipeptidasa B.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el análisis de la etapa c) comprende análisis de CL-EM, análisis de EC-peso de SDS o análisis de EM-IEP.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende:

a) proporcionar una preparación de anticuerpos,

b) opcionalmente aislar la parte de fragmento Fe de dicha preparación de anticuerpos,

c) eliminar todos los residuos sacáridos heterogéneos del anticuerpo o fragmento Fe con Endo Fl y Endo

S,

d) eliminar los residuos de lisina C-terminal del anticuerpo o fragmento Fe con carboxipeptidasa B,

e) análisis del anticuerpo o fragmento Fe mediante análisis de CL-EM, de EM-IEP o de EC-PM de SDS.

8. Método según la reivindicación 7, en el que la etapa e) comprende además una etapa de purificación previa al análisis.

9. Utilización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la determinación de la fucosilación cooperativa en una preparación de anticuerpos durante la fermentación.

1. Kit para la utilización en la detección cualitativa y cuantitativa de residuos de fucosa dentro de un péptido, que comprende Endo S, Endo H, plasmina, carboxipeptidasa B, instrucciones que proporcionan un procedimiento según cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 8 y un recipiente para el contenido del kit.

11. Utilización de Endo S para el corte de oligosacáridos complejos a partir de una glucoproteína en un método para detectar la presencia o la ausencia de residuos de fucosa dentro de un anticuerpo glucosilado o de un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.