Conversión por bisulfito mejorada de ADN.

Procedimiento para la conversión por bisulfito de ADN, en el que la reacción con bisulfito se lleva a cabo a una temperatura >50ºC y con un tiempo de reacción ≥

5 h y ≤ 18 h en presencia de un ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-5 2-carboxílico

Conversión por bisulfito mejorada de ADN.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de metilaciones de citosina en el ADN. La 5- metilcitosina es la base covalentemente modificada más frecuente en el ADN de las células eucariotas. Por ejemplo, ejerce un papel en la regulación de la transcripción, en la impronta genética y en la oncogénesis (véase: Millar ef al: Five not four: History and significance of the fifth base. En: S. Beck y A. Olek, eds.: The Epigenome. Wlley-VCH Verlag Weinheim, 23, p. 3-2). Por lo tanto, la identificación de la 5-metilcitosina como componente de la información genética tiene un interés considerable. Sin embargo, las posiciones de la 5-metilcitosina no se pueden identificar por secuenciación, ya que la 5-metilcitosina presenta el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Además, si se lleva a cabo una amplificación por PCR, la información epigenética, que reside en las 5-metilcitosinas, se pierde por completo.

Los métodos habituales para el análisis de la metilación funcionan esencialmente según dos principios diferentes. Se utilizan enzimas de restricción específicas de metilación o una conversión química selectiva de las citosinas no metiladas a uracilo (tratamiento con bisulfito). A continuación, el ADN pretratado enzimática o químicamente se amplifica y se puede analizar por diversos métodos (véase: Fraga y Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33: 632-649, septiembre de 22; WO 2/7288, p. 1 y siguientes).

Dado que la utilización de enzimas específicas de metilación está restringida a determinadas secuencias, que contienen sitios de restricción reconocidos por dichas enzimas, en la mayoría de las aplicaciones se lleva a cabo un tratamiento con bisulfito (véase: US 1/311.661).

Según la presente invención, "reacción con bisulfito", "tratamiento con bisulfito" o "método del bisulfito" se refieren a una reacción para la conversión de las bases de citosina presentes en un ácido nucleico en bases de uracilo en presencia de iones bisulfito, no convirtiéndose significativamente las bases de 5-metilcitosina. La reacción con bisulfito comprende una etapa de desanimación y una etapa de desulfonación que pueden llevarse a cabo por separado o simultáneamente (se describen más detalles y se muestra un esquema de reacción en el documento EP 1 394 172 A1). Existen diversos documentos que se refieren a aspectos específicos de la reacción con bisulfito, entre ellos Hayatsu et al, Biochemistry 9 (197) 2858-28659; Slae y Shapiro, J. Org. Chem. 43 (1978) 4197-42; Paulin et al, Nucí. Acids Res. 26 (1998) 59-51; Raizis et al, Anal. Biochem. 226 (1995), 161-1666; Wang et al Nucleic Acids Res. 8 (198) 4777-479. Estos documentos se resumen en el documento EP 1 394 172 A1.

Habitualmente, el tratamiento con bisulfito se lleva a cabo de la siguiente manera: el ADN genómico se aísla, se fragmenta mecánica o enzimáticamente, se desnaturaliza con NaOH, se convierte durante varias horas mediante una solución concentrada de bisulfito y, por último, se somete a desulfonación y desalación (por ejemplo: Frommer et al: A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Nati. Acad. Sci. USA, 1 de marzo de 1992; 89(5): 1827-31).

Recientemente, se han desarrollado una serie de mejoras técnicas en los métodos por bisulfito. El método de bolas de agarosa incorpora el ADN que se debe analizar en una matriz de agarosa, a través de la cual se impide la difusión y la renaturalización del ADN (el bisulfito sólo reacciona con el ADN monocatenario) y todas las etapas de precipitación y purificación se sustituyen por diálisis rápida (Olek A. et al, A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis, Nucí. Acids Res. 1996, 24, 564-566). En la solicitud de patente WO 1/98528 (= DE 1 29 915; = solicitud de patente US 1/311.661) se describe una conversión por bisulfito en la que la muestra de ADN se incuba con una solución de bisulfito con una concentración comprendida entre ,1 mol/l y 6 mol/l en presencia de un reactivo y/o disolvente de desnaturalización y por lo menos un captador. En dicha solicitud de patente se describen diversos reactivos desnaturalizantes y captadores adecuados. En la solicitud de patente WO 3/38121 (= DE 11 54 317; = US 1/416.624) se describe un método en el que el ADN que se debe analizar está unido a una superficie sólida durante el tratamiento con bisulfito. En consecuencia, se facilitan las etapas de purificación y lavado. En las solicitudes de patente EP 1 394 173 A1 y EP 1 394 172 A1 se describen otras mejoras. La solicitud de patente PCT/EP24/11715 (= DE 13 47 396.3; DE 13 47 397.1; DE 13 47 4.5; DE 13 47 399.8) describe un tratamiento con bisulfito mejorado mediante la utilización de dioxano o compuestos de n- alquilenglicol junto con un programa de temperatura especial y una etapa especial de purificación por ultrafiltración. En dicha solicitud de patente se describe una temperatura de reacción de 5°C durante 5 h (ejemplo 2).

Sin embargo, un problema básico del tratamiento con bisulfito consiste en el hecho de que son necesarios tiempos de reacción prolongados para asegurar la compleción de la conversión y excluir falsos positivos. Sin embargo, esto provoca a la vez la degradación del ADN debido a estos tiempos de reacción prolongados. Una temperatura de reacción más elevada da como resultado una mayor tasa de conversión, pero también una degradación más intensa del ADN. Recientemente se han investigado sistemáticamente las interacciones entre la temperatura, el tiempo de reacción, la tasa de conversión y la degradación. De esta manera se pudo poner de manifiesto que se alcanzan las mayores tasas de conversión a una temperatura de 55°C (con un tiempo de reacción comprendido entre 4 y 18

horas) y de 95°C (con un tiempo de reacción de una hora). Sin embargo, la degradación del ADN durante este procedimiento constituye un grave problema. Se describe el hecho de que, a una temperatura de reacción de 55°C, se descompone el 84-96% del ADN. A 95°C, la degradación es incluso mayor (Grunau ef al: Bisulfite genomic sequenclng: systematlc ¡nvestlgatlon of critical experimental parameters. Nucleic Acids Res. 1 de julio de 21; 29(13):E65-5). En consecuencia, la mayoría de los autores aplican temperaturas de reacción de aproximadamente 5°C (véase: Frommer et al, loe. cit. 1992, p. 1827; Olek et al, loe. cit. 1996, p. 565; Raizis et al: A bisulfite method of 5-methylcytoslne mapplng that mlnimizes témplate degradaron, Anal Biochem., 2 de marzo de 1995; 226(1): 161- 6, 162). En la solicitud de patente WO 24/67545 A1 (solicitante: Hoffmann-La Roche) se da a conocer un tratamiento con bisulfito mejorado en el que se aplica una temperatura de reacción comprendida entre 7°C y 9°C durante un período comprendido entre 1,5 horas y 3,5 horas.

Warnecke ef al (Identification and resolution of artifaets ¡n bisulfite sequencing; METHODS (ORLANDO), vol. 27, n° 2, junio de 22 (22-6), p. 11-17) y Clark ef a/ (High sensltlvity mapping of methylated cytosines; Nucleic Acids Res. 1994, vol. 22, n° 15, p. 299-2997) dan a conocer un protocolo de tratamiento estándar con bisulfito que se utiliza para la conversión de ADN. Dicho tratamiento comprende la incubación de bisulfito de sodio a 55°C durante 16 horas en presencia de hidroquinona, que es un captador de radicales.

El documento DE 1 5 942 A1 da a conocer el tratamiento con bisulfito de ADN en presencia de un agente desnaturalizante y/o en presencia de un captador de radicales.

Debido a las elevadas pérdidas del tratamiento convencional con bisulfito, resulta problemático aplicar estos métodos en Investigaciones en las que la cantidad de ADN que se pretende analizar es limitada. Sin embargo, un campo particularmente interesante del análisis de metllaclón consiste en el diagnóstico de enfermedades cancerosas ef al trastornos asociados a un cambio en el estado de metilación mediante el análisis del ADN a partir de fluidos corporales, por ejemplo, la sangre o la orina. Aun así, el ADN está presente sólo en pequeñas concentraciones en dichos fluidos corporales, de modo que la apllcabilidad del análisis de metilación resulta limitada por el bajo rendimiento del tratamiento convencional con bisulfito.

En consecuencia, debido a la particular importancia del análisis de metilación de citosina y a las desventajas anteriormente descritas de la metodología convencional, existe una gran necesidad técnica de métodos mejorados de conversión por bisulfito.

Se ha descubierto que, en determinadas condiciones de reacción optimizadas, utilizando... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la conversión por bisulfito de ADN, en el que la reacción con bisulfito se lleva a cabo a una temperatura > 5°C y con un tiempo de reacción > 5 h y < 18 h en presencia de un ácido 6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcroman-2-carboxílico.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la reacción con bisulfito se lleva a cabo a una temperatura > 55°C.

3. Procedimiento para la conversión por bisulfito de ADN según la reivindicación 1 o 2, en el que la reacción con bisulfito se lleva a cabo a una temperatura de 6°C durante 5 h o a una temperatura de 55°C durante 7 h.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además por que se analiza ADN derivado de fluidos corporales.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado además por que el fluido corporal es sangre o plasma.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además por que la conversión por bisulfito se lleva a cabo en presencia de un compuesto seleccionado de entre el grupo de dioxano, uno de sus derivados y un éter cíclico alifático similar.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además por que la conversión por bisulfito se lleva a cabo en ausencia de disolventes o reactivos desnaturalizantes.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además por que la temperatura de reacción se aumenta hasta un intervalo de 85 a 1°C brevemente durante el curso de la conversión (pico térmico).

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además por que el ADN convertido se purifica mediante ultrafiltración.

1. Utilización de un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9 en el diagnóstico y/o el pronóstico de episodios adversos en pacientes o individuos, perteneciendo dichos episodios adversos a por lo menos una de las categorías siguientes: interacciones con fármacos no deseadas; enfermedades cancerosas; disfunciones, daños o enfermedades del SNC; síntomas de agresividad o alteraciones del comportamiento; consecuencias clínicas y psicológicas de daños cerebrales; alteraciones psicóticas y trastornos de la personalidad; demencia y/o síndromes asociados; enfermedades, disfunciones y daños cardiovasculares; disfunciones, daños o enfermedades del tubo gastrointestinal; disfunciones, daños o enfermedades del sistema respiratorio; lesión, inflamación, infección, inmunidad y/o convalecencia; disfunciones, daños o enfermedades del organismo como anomalía en el proceso de desarrollo; disfunciones, daños o enfermedades de la piel, de los músculos, del tejido conjuntivo o de los huesos; disfunciones, daños o enfermedades endocrinas y metabólicas; cefaleas o disfunciones sexuales.