Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro.

Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro.

La presente invención se refiere al sector del análisis clínico de la sangre y, más en particular, se refiere a una composición que comprende plasma humano, solución isotónica tamponada y ácido ferúlico para utilizar en el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia, coagulación y fibrinolisis. Además, la presente invención se refiere a la utilización de ácido ferúlico en la preparación de un control anormal de plasma en ensayos de hemostasia.

Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro

La presente invención se refiere al sector del análisis clínico de la sangre y, más en particular, se refiere a una composición que comprende plasma humano, solución isotónica tamponada y ácido ferúlico para utilizar en el control anormal de la coagulación en ensayos de hemostasia, coagulación y fibrinolisis. Además, la presente invención se refiere a la utilización de ácido ferúlico en la preparación de un control anormal de plasma en ensayos de hemostasia.

La hemostasia es el conjunto de mecanismos a través de los cuales los animales con un sistema vascular evitan desangrarse tras una herida. El mecanismo de la hemostasia tiene distintas funciones importantes: (a) mantener la sangre en estado fluido cuando circula dentro del sistema vascular, (b) detener la hemorragia en el lugar donde se ha producido una herida o haya pérdida de sangre a través de la formación de un coágulo, y (c) asegurar la eliminación del coágulo cuando la herida se ha curado. Habitualmente, en la hemostasia intervienen cinco elementos, a saber: los vasos sanguíneos, las plaquetas (componente celular), los factores de la coagulación, los inhibidores de la coagulación y el sistema fibrinolítico. La hemostasia, pues, involucra un grupo de fuerzas que deben interactuar en un perfecto equilibrio, las fuerzas procoagulantes y anticoagulantes. Este equilibrio está controlado por varias proteínas, algunas de ellas conocidas como factores de coagulación. Es un equilibrio muy delicado y en caso de desequilibrio, podría generar un estado protrombótico o un trastorno hemorrágico.

Es muy importante medir de forma precisa el funcionamiento de la coagulación, porque si existen deficiencias, pudieran amenazar la vida. Este hecho adquiere especial interés en el caso de pacientes sometidos a terapia de coagulación en condiciones tromboembolíticas.

El papel del laboratorio de hemostasia es detectar y conocer las alteraciones fisiológicas en enfermedades hemorrágicas y trombóticas. Para ello se utilizan diferentes ensayos tales como ensayos de hemostasia primaria, coagulométricos e inmunológicos, que permiten obtener información útil para guiar a los profesionales de la salud hacia un diagnóstico preciso y su tratamiento adecuado.

Los ensayos de hemostasia se pueden dividir en dos grupos diferentes: evaluación inicial de la hemostasia, en el que se pueden incluir el tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), la determinación de la concentración de fibrinógeno y tiempo de trombina (TT); en el otro grupo se pueden incluir ensayos especiales tales como el tiempo de reptilasa (RT), el tiempo de coagulación activada (ACT), la determinación de la concentración de antitrombina (AT), de Proteína C, de Proteína S, de factor de von Willebrand, de plasminógeno y de a2-antiplasmina (inhibidor de plasmina).

En los laboratorios de hemostasia, muestras de pacientes son analizadas para una gran variedad de cribados de hemostasia y ensayos especiales durante toda la jornada de trabajo. En estos ensayos, el control metodológico de las variables que intervienen en la eficiencia y eficacia de los ensayos de hemostasia son esenciales para un diagnóstico correcto. Dentro de estos controles de calidad internos seguidos por los laboratorios, el uso de plasmas de control juega un papel muy importante.

Es extremadamente recomendable utilizar un control en el rango de tiempo de coagulación normal y otro en el rango anormal, en intervalos regulares para asegurar el funcionamiento correcto de los reactivos y dispositivos utilizados en el laboratorio de hemostasia. Existen recomendaciones publicadas en relación con la frecuencia de ensayo de los materiales de control para algunos ensayos de coagulación. Por ejemplo, el CLSI (siglas en inglés del Instituto de Estándares de Laboratorios Clínicos) ha publicado documentos de guía en relación con los ensayos PT y aPTT. En dicho documento, se recomienda ensayar, como mínimo, dos niveles de materiales de control cada 8 horas, o más frecuentemente si ocurre un procesado de muestras de forma continua, tal como ocurre en muchos laboratorios. Este documento de CLSI también indica que el primer ensayo realizado después de cambios o incorporación de nuevos reactivos o de un cambio importante de instrumentos debe ser con la muestra de control. Los controles permiten evaluar la precisión y la desviación analítica de los ensayos de coagulación en el sistema empleado de coagulómetro y reactivos utilizados.

Existe literatura publicada en relación con la preparación de plasma de control de la coagulación y actualmente están comercialmente disponibles algunos de ellos. Sin embargo, la mayoría de los métodos descritos requieren mucho tiempo e incluyen etapas costosas para absorber factores proteicos críticos del plasma para obtener las propiedades de coagulación

anormales. Un método para preparar plasma de control anormal de coagulación comprende la incubación de plasma normal con hidróxido de aluminio y su posterior centrifugación. El sedimento contiene varios factores de coagulación y el sobrenadante resultante se puede emplear como plasma de control patológico. Los tiempos de coagulación anormales se consiguen mediante la eliminación de los factores de coagulación del plasma. Sin embargo, el plasma de control de la coagulación obtenido de esta manera no es completamente satisfactorio, porque se obtienen resultados anormales en algunos ensayos, pero en otros la actividad está en el rango normal, por ejemplo, factor VIII, XI y XII, así como en otros ensayos de hemostasia tales como TT y RT.

Otro método para generar un control anormal de la coagulación es diluir el plasma normal. Dicho método se describe en una guía internacional (NCCLS H30-A2), en la que se menciona como preparar un plasma de control anormal para la determinación de fibrinógeno según el método Clauss. Además, se describe que se puede diluir un conjunto de plasmas normales con tampón barbital para obtener plasma con un resultado anormal (bajo contenido en fibrinógeno). El resultado final de la dilución de un conjunto de plasmas normales resulta anormal para la mayoría de los ensayos de hemostasia. Sin embargo, este plasma de control de la coagulación no es anormal, por ejemplo, para TT y RT. El mismo resultado se obtiene mediante la dilución de plasma normal con otras soluciones tal como una solución de albúmina al 4%.

La presente invención da a conocer un plasma de control anormal de la coagulación que supera todos los inconvenientes mencionados anteriormente. El plasma de control anormal de la presente invención garantiza resultados en el rango anormal en un gran número de ensayos de hemostasia, incluyendo TT, RT y la determinación de actividad de los factores específicos de la coagulación. Los presentes inventores han descubierto, sorprendentemente, que mediante la adición de ácido ferúlico en una solución isotónica a un plasma normal se puede obtener un plasma de control anormal que puede ser utilizado de forma eficaz en la mayoría de los ensayos de hemostasia.

Sin estar asociados a ninguna teoría en particular, es posible que esta propiedad del ácido ferúlico se obtenga por una propiedad característica anticoagulante de dicha sustancia. No obstante, el hecho de que una sustancia posea propiedades anticoagulantes, no indica que sea apropiada para generar un plasma anormal. Por ejemplo, la warfarina es uno de los

anticoagulantes más utilizados en sanidad para tratar los pacientes con riesgo trombótico y lleva más de 50 años utilizándose como medicamento. Sin embargo, este compuesto no es útil para ser añadido en un plasma y generar un control anormal de la coagulación, ya que su mecanismo de acción se basa en la inhibición de la síntesis de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Como anticoagulante requiere de un sistema in vivo completo.

Otros compuestos con actividad anticoagulante, como la heparina o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sí que pueden ser añadidos a plasma normal y generar tiempos anormales en los ensayos de hemostasia. Sin embargo, los presentes inventores no han obtenido resultados similares con los anticoagulantes heparina o EDTA. Ambos anticoagulantes no son idóneos para generar un plasma anormal, ya que presentan un efecto desigual sobre los ensayos de hemostasia. Es decir, la concentración óptima para obtener un tiempo anormal en un ensayo es insuficiente o excesiva para otro ensayo. Por ejemplo, en el caso de la heparina, provoca un alargamiento del ensayo aPTT pero no afecta al ensayo PT o lo hace en menor medida. Además, la heparina no provoca el alargamiento...

1. Composición para su utilización como plasma de control anormal de la coagulación en ensayos in vitro, comprendiendo dicha composición: plasma humano, solución isotónica tamponada y ácido ferúlico, caracterizada porque dicho plasma humano se ha obtenido mediante métodos conocidos de extracción de plasma humano y porque dicha solución isotónica tamponada tiene un pH entre 6,5 y 8,5.

2. Composición, según la reivindicación 1, caracterizada porque el plasma humano es un plasma que presenta un valor de tiempo normal de coagulación en diferentes ensayos de coagulación.

3. Composición, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el plasma humano es un conjunto (pool) de plasma normal que contiene plasma de 2 o más donantes humanos sanos.

4. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la concentración del plasma humano está en el intervalo de 15% a 75% (v/v).

5. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cantidad de dicha solución isotónica está en el intervalo de 40 a 70% (v/v).

6. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cantidad de ácido ferúlico está en el intervalo de 0,01% a 1% (p/v).

7. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende un agente estabilizador de factores de coagulación.

8. Composición, según la reivindicación 7, caracterizada porque el estabilizador de factores de coagulación es glicina.

9. Composición, según la reivindicación 8, caracterizada porque la glicina está presente en dicha composición en una cantidad de 0,1% a 4% (p/v).

10. Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque además comprende un agente estabilizante de proteínas y un conservante.

11. Uso de ácido ferúlico en la preparación de un control anormal de la coagulación en ensayos in vitro.