Células madre mesenquimales positivas para ABCB5 como moduladoras de inmunidad.

Un método de obtener una preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 a partir de una muestra de piel que se había obtenido a partir de un donante humano,

que comprende:

(i) aislar células dérmicas positivas para ABCB5 a partir de la muestra de piel usando un anticuerpo contra ABCB5;

(ii) expandir las células dérmicas positivas para ABCB5 por una clonación de diluciones limitadoras o una cultivación por expansión de las células para producir la preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas moduladoras de inmunidad; y

(iii) formular las células dérmicas positivas para ABCB5 en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde las células dérmicas positivas para ABCB5 constituyen por lo menos un 95 % de la preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5.

Células madre mesenquimales positivas para ABCB5 como moduladoras de inmunidad Campo del invento

La presente solicitud describe unas células madre mesenquimales moduladoras de inmunidad que son positivas 5 para ABCB5 y a su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada inmunológicamente.

Antecedentes del invento

Las estrategias moduladoras de inmunidad basadas en células madre constituyen una nueva frontera terapéutica en un alotrasplante clínico (Frank y colaboradores Lancet 363:1411 (24)). Se ha encontrado, por ejemplo, que unas células madre mesenquimales que se derivan de la médula ósea de un adulto (BM-MSC, acrónimo de bone marrow 1 derived mesenchymal stem cells) pueden inhibir in vitro la proliferación de células T como respuesta a mitógenos y a aloantígenos (Le Blanc y colaboradores Scand. J. Immunol. 57:11 (23); Rasmusson y colaboradores Exp. Cell Res. 35:33 (25)). A causa de su fácil accesibilidad, la piel es una fuente potencial particularmente atractiva de unas células madre que son útiles terapéuticamente. Sin embargo, la identificación de unos marcadores moleculares para el aislamiento y la expansión de células madre dérmicas puras es un importante problema, y son ampliamente 15 desconocidos los efectos biológicos que son específicos para estas células.

Recientemente, se clonó una nueva glicoproteína P ABCB5 transportadora con una casete de fijación de ATP (ABC, acrónimo de ATP-binding cassette) humana, y se ha sugerido que esta proteína puede servir como una marcadora para el aislamiento de una subpoblación de células madre (Frank y colaboradores J. Biol. Chem. 278:47156 (23); Frank y colaboradores Cáncer Res. 65:432 (25); documento de patente de los EE.UU. US 6,346,833).

Sumario del invento

El presente invento está basado en parte en el descubrimiento de que unas células madre mesenquimales dérmicas que expresan la ABCB5 tienen unas propiedades moduladoras de inmunidad y pueden ser útiles para el tratamiento de unas enfermedades mediadas inmunológicamente. La proteína ABCB5 es expresada sobre la superficie de unas células madre y se puede usar tanto en su identificación, p.ej. usando una inmunofluorescencia, y una purificación, 25 p.ej. usando unos anticuerpos inmovilizados sobre un substrato inerte.

En un primer aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 1)

En un segundo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 4)

En un tercer aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 5)

En un cuarto aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 6)

En un quinto aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 11)

En un sexto aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 12)

En un séptimo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 13)

En un octavo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 14)

En un noveno aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 15)

En un décimo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 16)

En un undécimo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 17)

En un duodécimo aspecto del invento se proporciona (introducir el texto de la reivindicación 19)

Se describen en la presente memoria varios métodos de administrar a un individuo una composición para el

tratamiento de una condición particular. Ha de entenderse que esto incluye específicamente, también, la

composición destinada a su uso en el tratamiento de esa condición particular, así como el uso de la composición para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de esa condición particular.

Otras ventajas y nuevas particularidades del presente invento resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de diversas formas de realización del invento no limitativas, cuando ésta se considere en conjunción con las figuras anejas.

Este Invento no está limitado en su aplicación a los detalles de construcción y a la disposición de componentes que se exponen en la siguiente descripción o se ilustran en los dibujos. El Invento es capaz de otras formas de realización y de ser practicado o de ser llevado a cabo de diversas maneras. También la fraseología y la terminología que aquí se utilizan se presentan con una finalidad de descripción y no deberán ser consideradas como limitativas. Se entiende que el uso de los términos "que Incluye", "que comprende" o "que tiene", "que contiene", "que Implica" y de unas variaciones de estas palabras en el presente texto abarca los detalles enumerados después de esto y los equivalentes de los mismos así como unos detalles adicionales.

Breve descripción de los dibujos

No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. En estos dibujos, cada componente Idéntico o casi Idéntico que se ¡lustra en diversas figuras es representado por número similar. Para unas finalidades de claridad, cualquiera de los componentes puede ser marcado en cada uno de los dibujos. En estos dibujos:

Figura 1. Unos gráficos que representan unos análisis por citometría de flujo en un único color de la expresión de ABCB5 en la superficie de unos cultivos derivados de una piel de Balb/c murino en subcultivos tempranos (A) y después de > 4 subcultivos (B), línea de color gris claro ABCB5; sombreada: testigo de isotipo; línea de color negro oscuro: no teñida

Figura 2. Un gráfico de barras que representa la pauta de expresión de unos marcadores de MSC en unas MSC dérmicas no separadas (barras macizas) frente a la de unas MSC dérmicas ABCB5' (barras punteadas) o ABCB5+ (barras rayadas), determinada por una citometría de flujo de doble color.

Figura 3. Unos gráficos de Kaplan-Meier que representan la supervivencia de un injerto en (A) unos recipientes B6 de corazones de donantes Balb/c, tratados con unas MSC que se derivan de los donantes, y (B) con y sin un bloqueo concurrente de CD4L, usando el mAb (anticuerpo monoclonal) anti-CD4L, MR1. (C) unos gráficos de Kaplan-Meier que representan la supervivencia de un injerto en unos recipientes B6 de corazones de donantes C3H, tratados con unas MSC que se derivan de una tercera parte, y en (D) recipientes Balb/c de corazones de donantes B6, tratados con unas MSC que se derivan de los recipientes. Las diferencias estadísticas, tal como se indican por unos valores de P para cada combinación de raza, se averiguaron usando el ensayo de log-rango.

Figura 4. Unas representaciones gráficas de puntos que describen unos análisis por citometría de flujo en doble color de unos cultivos derivados de una piel murina de Balb/c para la expresión de ABCB5 (FITC, fluorescencia FL1) y para los marcadores PD-1, PD-L1, PD-L2 (PE, fluorescencia FL2). Unas células ABCB5+ que expresan concomitantemente los respectivos marcadores de superficie son halladas en el cuadrante derecho superior de cada representación gráfica de fluorescencia.

Figura 5. Unos gráficos de barras que representan la expresión in vivo de PD-1, PD-L1 y PD-L2 en células CD4+ CD8+ y CD11c+ de recipientes plenamente mal emparejados a los 7 días después de un alotrasplante de 3x1® MSC, que es determinada por una citometría de flujo. Los testigos no tratados (en barras macizas), los con tratamiento con MSC (en barras punteadas), los con tratamiento con esplenocitos (en barras rayadas); NS: no significativos; El o los valor(es) de P indican unos cambios estadísticamente significativos.

Figura 6. Un gráfico de barras que representa la expresión de CD4 (% de positividad, media ± SEM) (SEM es el acrónimo de Standard Error ofthe Mean = error típico de la media) determinado por una citometría de flujo en doble color en unos subconjuntos de esplenocitos APC CD11c+ que se derivan de los bazos o bien de unos animales tratados con MSC (a los 7 días después de una inyección i.v. (intravenosa) de 3x1® MSC dérmicas ABCB5+) (barra de color gris, marcada con TRATAMIENTO CON MSC) o de unos animales testigos no tratados (barra de color negro, marcada con SIN TRATAMIENTO). B y C. Unos gráficos que representan la absorción de 3H-timidina de unas células T purificadas procedentes de ratones C57BL6 o bien tratados con MSC dérmicas ABCB5+ (a los 7 días después de una inyección i.v. de 3x1® MSC dérmicas ABCB5+) o no tratados, después de una aloestimulación durante 12 horas en unas típicas reacciones con linfocitos mezclados (MLR) en una vía, con esplenocitos de Balb/c (B) o de C3H/HeJ (C) ingenuos irradiados... [Seguir leyendo]

1. Un método de obtener una preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 a partir de una muestra de piel que se había obtenido a partir de un donante humano, que comprende:

(i) aislar células dérmicas positivas para ABCB5 a partir de la muestra de piel usando un anticuerpo contra ABCB5;

(ii) expandir las células dérmicas positivas para ABCB5 por una clonación de diluciones limitadoras o una cultivación por expansión de las células para producir la preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas moduladoras de inmunidad; y

(iii) formular las células dérmicas positivas para ABCB5 en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde las células dérmicas positivas para ABCB5 constituyen por lo menos un 95 % de la preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5.

2. El método de la reivindicación 1, en el que las células dérmicas positivas para ABCB5 son aisladas usando un anticuerpo inmovilizado contra ABCB5.

3. El método de la reivindicación 2, en el que unas células dérmicas positivas para ABCB5, son aisladas usando un anticuerpo que ha sido inmovilizado sobre perlas y luego expandido por clonación de diluciones limitadoras.

4. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en una terapia.

5. Una composición de una preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 caracterizada por la expresión de ABCB5 en la superficie de sus células, formulada en un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable que es un tampón acuoso isotónico estéril, en la que las células dérmicas positivas para ABCB5 constituyen por lo menos un 95 % de la preparación sustancialmente pura aislada de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5.

6. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de un individuo que tiene un trasplante de órgano para favorecer la supervivencia de un aloinjerto, opcionalmente en donde el aloinjerto está seleccionado entre el conjunto que consiste en: corazón, cerebro, pulmones; hígado; y riñón.

7. La composición destinada a su uso en el tratamiento de un individuo de acuerdo con la reivindicación 6, en la que las células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 son singeneicas.

8. La composición destinada a su uso en el tratamiento de un individuo de acuerdo con la reivindicación 6, en la que las células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 son alogeneicas.

9. La composición destinada a su uso en el tratamiento de un individuo de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 son administradas al individuo al menos en un momento seleccionado entre

a) antes del trasplante de los órganos;

b) al mismo tiempo que los trasplantes de los órganos; o

c) después del trasplante de los órganos.

1. La composición destinada a su uso en el tratamiento de un individuo de acuerdo con la reivindicación 6, en la que las células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 tienen como exógeno un ácido nucleico que es opcionalmente un vector.

11. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, opcionalmente en la que la enfermedad autoinmunitaria se selecciona del conjunto que consiste en: esclerosis múltiple; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso; escleroderma; psoriasis; miastenia grave; la enfermedad de Grave; la enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa.

12. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de una enfermedad de hígado, opcionalmente en la que la enfermedad de hígado es una hepatitis.

13. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en la que la enfermedad neurodegenerativa está asociada con

una respuesta ¡nmunitaria contra células del anfitrión y opcionalmente en la que la enfermedad neurodegenerativa es la esclerosis lateral amiotrófica.

14 Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de una enfermedad cardiovascular, en donde la enfermedad cardiovascular está asociada con una remodelación de tejido, opcionalmente en donde la enfermedad cardiovascular es una aterosclerosis o un infarto de

miocardio.

15. Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5 destinada a su uso en el tratamiento de un daño para un tejido en un individuo que necesita de éste, en donde el tejido es un hueso o un cartílago.

16 Una composición de células madre mesenquimales dérmicas positivas para ABCB5, destinada a su uso en el tratamiento de una enfermedad de riñón.

17. Una preparación aislada de células madre mesenquimales dérmicas moduladoras de inmunidad, caracterizada por la expresión de ABCB5 en la superficie de sus células, opcionalmente en donde la preparación aislada de células madre mesenquimales dérmicas moduladoras de inmunidad es sustancialmente pura.

18. Un vial de inyección previamente llenado, una ampolla o una bolsa de infusión que comprende, en una forma de dosificación unitaria, las células madre mesenquimales dérmicas aisladas de la reivindicación 17.

19. Un estuche que comprende un vial de inyección previamente llenado, una ampolla o una bolsa de infusión en una forma de dosificación unitaria que comprende unas células madre mesenquimales dérmicas moduladoras de inmunidad aisladas que expresan ABCB5 en la superficie de sus células, opcionalmente en donde el vial de inyección, la ampolla o la bolsa de infusión comprende 1 x 18 - 5 x 19 células madre mesenquimales dérmicas conjuntamente con unas instrucciones acerca de la administración de las células madre mesenquimales dérmicas o bien a un individuo que ha sido sometido, o que está presto para ser sometido, a un trasplante de órgano, o a un individuo que tiene una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad de hígado, una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad cardiovascular.