Aumento de la viabilidad y tolerancia de estrés de material biológico viable.

uso de la presión hidrostática para mejorar la viabilidad de material biológico viable no destinado a la crioconservación,

en el que dicho material biológico es un oocito de un animal vertebrado, que comprende:

(a) aplicar una presión hidrostática en el intervalo de 10 a 100 MPa a dicho material biológico;

(b) mantener dicho material biológico viable a la presión hidrostática durante un periodo de tiempo de entre 10 segundos a 150 minutos;

(c) liberar la presión hidrostática;

con la condición de que dicho material biológico viable no es humano.

Aumento de la viabilidad y tolerancia de estrés de material biológico viable

La presente invención se refiere al uso de la presión hidrostática para mejorar la viablidad de material biológico viable no destinado a la crioconservación, en el que dicho material biológico es un oocito de un animal vertebrado, con la condición de que dicho material biológico viable no es humano.

Antecedentes de la técnica

Los mecanismos fisiológicos mediante los cuales los micoorganismos se adaptan a estreses subletales aún no se comprenden bien. Recientes estudios indican que las inestabilidades provocadas por un choque por frío subletal en la síntesis normal de proteínas en bacterias son superadas por la síntesis de las llamadas proteínas de choque por frío (CSP) (Phadtare et al., 1999). Se sospecha que estas CSP tienen muchas funciones, tales como chaperonas de ARN (Graumann y Marahiel, 1999) o activadores de la transcripción (LaTena et al., 1991); se supone que también desempeñan un papel en la protección frente a la congelación (Wouters et al., 1999). Otras investigaciones han descubierto que la producción de CSP es inducida no solo por un choque por frío, sino también por otros estreses ambientales. En Escherícha coli, por ejemplo, se produce un tipo de CSP por estrés nutricional (Yamanaka et al., 1998).

Otro ensayo ha demostrado que un tratamiento con alta presión hidrostática provoca la producción de ciertas proteínas inducidas por frío y proteínas de choque térmico (Welch et al., 1993). Puesto que ambos tratamientos de choque por frío y de alta presión aumentan los niveles de CSP, se han realizado ensayos acerca de la posibilidad de protección cruzada. Wemekamp-Kamphuis et al. (22) han descubierto que el nivel de supervivencia después de una presurización de Listeria monocytogenes tras un choque por frío es 1 veces mayor que el de células cultivadas a 37 °C.

Una presión hidrostática en el Intervalo de 3-5 MPa habitualmente inhibe el crecimiento de diversos organismos: el ¡nielo de la replicación del ADN es uno de los procesos intracelulares más sensibles a la presión (Abe et al., 1999). Los efectos varían en gravedad dependiendo de la magnitud y la duración de la compresión (Murakami y Zimmerman, 1973). Se advierte que la membrana celular es un sitio importante de daños por presión (Palou et al., 1997). Un tratamiento con alta presión hidrostática puede alterar la funcionalidad de la membrana, por ejemplo el transporte activo o la permeabilidad pasiva, y por tanto puede perturbar el equilibrio fisicoquímico de la célula (Yager y Chang, 1983; Aldridge y Bruner, 1985; Macdonald, 1987; Schuster y Sleytr, 22; Routray et al., 22). La aplicación de presión puede conducir a cambios en la estructura de las proteínas, que incluyen conformaciones parcial o completamente desplegadas. La presión puede provocar la desnaturalización de proteínas (Schmid et al., 1975; Webery Drickamer, 1983; Jaenicke, 1991; Gross y Jaenicke, 1994; Silva et al., 21). Informes recientes han indicado que la presión hidrostática potencia la producción de proteínas de choque (Welch et al., 1993; Wemekamp- Kamphuis et al., 22).

Los procesos físicos o bioquímicos en condiciones de presión alterada están gobernados por el principio de Le Chatelier: todas las reacciones que están acompañadas por una disminución de volumen se aceleran considerablemente (Murakami y Zimmerman, 1973; Welch et al., 1993; Palou et al., 1997). La acumulación de los efectos de la presión es letal más allá de un cierto nivel: aunque se producen cambios irreversibles en algunas biomoléculas a presiones más altas, a 3 MPa la mayoría de las bacterias y los organismos multicelulares mueren. Sin embargo, los tardígrados (que en su estado activo mueren entre 1 y 2 MPa) pueden sobrevivir hasta a 6 MPa si se encuentran en un estado deshidratado (Seki y Toyoshima, 1998). Una publicación anterior demostró que los sistemas biológicos son capaces de tolerar presiones altas con la condición de que la presión se reduzca lentamente (Johnson et al., 1954). Pribenszky et al. (23, 24) también exploraron la posibilidad de una retirada gradual de embriones presurizados y descubrieron que la liberación gradual de la presión aumenta significativamente la supervivencia.

Molnar et al. (22) estudiaron la tolerancia a la presión de embriones de ratón. Se emplearon diferentes presiones para definir el límite de tolerancia de los embriones in vitro. Los embriones que recibieron diferentes tratamientos de HHP se trasladaron a madres adoptivas para determinar si eran capaces de desarrollarse en crías sanas. Concluyeron que los embriones puede sobrevivir a una HHP in vitro e in vivo.

Ferruzza et al. (1979) intentaron establecer los niveles de tolerancia frente a un tratamiento con HHP utilizando huevos de ascidias. El estudio solo menciona los efectos perjudiciales de la HHP para los huevos de ascidias, y concluyó que los huevos pueden sobrevivir a la presión en algunas etapas del desarrollo.

Arai (1986) empleó la presión hidrostática para bloquear la extrusión del segundo cuerpo polar y para introducir alotripliodía en huevos de salmón. El estudió concluyó que una HHP puede provocar halotriploidía cuando se hibridan diferentes especies de salmón, y descubrió que una HHP puede mejorar la probabilidad de que se produzcan con éxito acontecimientos de hibridación.

En respuesta a diferentes estímulos de estrés, son inducidos genes de choque térmico para expresar proteínas de choque térmico (HSP). Estudios previos han revelado que la expresión de genes de choque térmico es regulada a

nivel transcripcional y postranscripcional, y que la rápida inducción transcripcional de genes de choque térmico implica la activación del factor de transcripción específico, factor de choque térmico 1 (HSF1). Además, la inducción transcripcional puede variar en intensidad y cinética de una manera dependiente de la señal y del tipo celular. Kaarniranta et al. (1998) demostraron que la carga mecánica en forma de presión hidrostática aumenta la expresión de genes de choque térmico en células similares a condrocitos humanos. La respuesta a una HHP continua se caracteriza por unos niveles elevados de ARNm y de proteínas de HSP7, sin la activación de HSF1 y la inducción transcripcional del gen hsp7. La mayor expresión de FISP7 fue mediada a través de la estabilización de moléculas de ARNm de hsp7. De modo interesante, en contraste con la presurización estática, la carga hidrostática cíclica no da como resultado la inducción de genes de choque térmico. Los descubrimientos de Kaarniranta et al. (1998) demuestran que la expresión del gen hsp7 es regulada de modo postranscripcional sin la inducción transcripcional en células similares a condrocitos tras la exposición a una alta presión hidrostática continua. Sugirieron que la regulación postranscripcional en forma de la estabilización del ARNm de hsp7 proporciona otro modo de regulación de los genes de choque térmico que es probable que tenga una importancia significativa en ciertas formas de estrés.

Previamente, los presentes inventores descubrieron que un choque subletal, una alta presión hidrostática (HHP), mejora significativamente la supervivencia postcongelación de blastocistos de ratón congelados (Pribenszky et al., 25a, documento W2522996). De modo similar, en la crioconservación de semen, la motilidad media postcongelación fue significativamente superior con un pretratamiento de presión en cada semen bovino presurizado, comparado con muestras congeladas sin presurización previa. El resultado claramente describe el efecto beneficioso de un tratamiento previo con presión para la motilidad postcongelación de semen de toro crioconservado (Pribenszky et al., 25b). Otras investigaciones que exploran el entorno biológico y el cambio bioquímico durante el proceso de la HHP revelarán el mecanismo de sus efectos protectores. Sin embargo, estos estudios implican la crioconservación del material biológico después del pretratamento con HHP, que claramente no es posible, o de una baja eficacia con una diversidad de material biológico.

El proceso de enfriamiento o conservación del semen a unas temperaturas mayores que °C está bien establecido para conservar espermatozoides durante un corto periodo de tiempo (Plackett, et al., 1982; Pinto, 1999; O'Shea et al., 1964). Con un tratamiento (dilución) óptimo del semen y una conservación a unas temperaturas óptimas, el semen puede inseminarse con resultados de fertilidad aceptables (pero, obviamente, con unas tasas de concepción reducidas comparadas con la inseminación con semen fresco) a los 1-2 días después de la recolección (Gilí et al., 197; Goodman y Cain, 1993; Flarrop, 1954; Ijaz y Ducharme,... [Seguir leyendo]

1- El uso de la presión hidrostática para mejorar la viabilidad de material biológico viable no destinado a la crioconservación, en el que dicho material biológico es un oocito de un animal vertebrado, que comprende:

(a) aplicar una presión hidrostática en el intervalo de 1 a 1 MPa a dicho material biológico;

(b) mantener dicho material biológico viable a la presión hidrostática durante un periodo de tiempo de entre 1

segundos a 15 minutos;

(c) liberar la presión hidrostática;

con la condición de que dicho material biológico viable no es humano.

2.- El uso según la reivindicación 1, en el que dicho animal vertebrado es bovino, equino, caprino, ovino, porcino, 1 otro tipo de ganado, mascotas, primates.

3 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha presión hidrostática está en el intervalo de 2 a 75 MPa.

4 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha presión hidrostática está en el intervalo de 3 a 6 MPa.

5 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha presión hidrostática se aplica durante un

periodo de tiempo de entre 2 segundos a 9 minutos.

6 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha presión hidrostática se aplica durante un periodo de tiempo de entre 3 segundos a 6 minutos.

7 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha presión se libera gradualmente a lo largo

de un periodo de tiempo entre la liberación instantánea y 6 horas.

8 - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha presión se aplica, se mantiene y se libera

según un perfil de presión predeterminado.

9.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha presión se aplica, se mantiene y se libera según un perfil de temperatura predeterminado.