Aparato robusto para análisis de ácido nucleico y proteínas.

Un aparato (10) para procesar una muestra de analito biomolecular,

el aparato (10) comprende:

un soporte (20) para sostener un módulo de prueba (55) dicho módulo de prueba (55) comprende una placa transparente que comprende uno o más micro canales (110), en uso al menos un micro canal (110) que está en comunicación fluida con la muestra;

un dispositivo de electroforesis (30) conectado al soporte 20 para suministrar energía para el módulo de prueba (55); Una fuente de luz (60) para emitir un haz de luz que el uso excita la fluorescencia en la muestra del analito biomolecular; un detector de luz (64); y

una pluralidad de dispositivos ópticos (68, 70, 72) montados dentro del aparato; en donde dicha fuente de luz (60), detector de luz (64) y la pluralidad de dispositivos ópticos (68, 70, 72) se montaron rígidamente a una placa base única (80) para transmitir el haz de luz emitido por la fuente de luz (60) en uso al módulo de prueba (55) y desde el módulo de prueba al detector de luz (64), la placa base (80) que se forma de una pieza única de material y soportada por un m arco (82) que incluye al menos un dispositivo de amortiguamiento (84) para reducir la transmisión de vibración generada por debajo del marco (82) a la placa base (80).

Aparato robusto para análisis de ácido nucleico y proteínas Campo de la invención

La invención se relaciona de manera general con dispositivos para el análisis de ácido nucleico y/o proteínas, y más particularmente con dispositivos robustos con bajos requisitos de consumo de energía que se pueden utilizar para secuenciar o separar ácido nucleico y proteína en ambientes no controlados o semicontrolados que incluye laboratorios móviles, oficinas de médicos, laboratorios de hospital y otros laboratorios clínicos y/o de prueba para humanos, veterinarios o ambientales y puntos de ubicaciones para cuidados.

Antecedentes

El proyecto genoma humano ha catalizado el desarrollo de una amplia variedad de tecnologías para el análisis genómico. Un área principal de avances se relaciona con métodos de secuenciación de ADN. Además, también se han desarrollado varias importantes técnicas de detección de variación del genotipo y genética que incluyen detección de polimorfismo de nucleótido único (SNP), polimorfismo de conformación de cadena única (SS-CP), análisis heterodúplex (HA), análisis corto de repetición en tándem (STR) y micro satélite o de repetición de secuenciación simple (SSR).

Los métodos para secuenciación de ADN discutidos anteriormente utilizan electroforesis para separar fragmentos de ADN por tamaño, y el uso de marcas (más comúnmente tintes fluorescentemente marcados) para la detección de fragmentos específicos. Un gran número de tintes comercialmente disponibles y de ligadores asociados disponibles para la marcación de ácido nucleico de vendedores incluyen sondas Moleculares de Invitrogen.

Los métodos de secuenciación de ADN también se basan en el método de terminación de cadena (Sanger et al., 1977) y el método de degradación química (Maxam y Gilbert, 1977). En el secuenciación Sanger, la secuencia de una molécula de ADN de cadena única se determina mediante la síntesis enzimática de cadenas de poli nucleótidos complementarias, estas cadenas terminan en posiciones de nucleótido específicas. En el secuenciación Maxam y Gilbert, la secuencia de una molécula de ADN de cadena doble se determina mediante el tratamiento con químicos que fragmentan la molécula en posiciones de nucleótido específicas. Ambos métodos de secuenciación utilizan marcas de tinte para identificar cada una de las bases y la separación basada en electroforesis para determinar el tamaño del fragmento de la cadena que finaliza con una base dada.

Las reacciones basadas en Sanger que utilizan cebadores de tinte o terminadores de tinte en la reacción para generar fragmentos de ADN con marca para el análisis son de amplio uso hoy. Numerosos vendedores de kits de secuenciación de ciclo comercialmente disponibles incluyen Applied Biosystems and Ge Amersham. Estos kits comercial mente disponibles utilizan los tintes R11, R6G, TMR y ROX (Kits de Secuenciación de Ciclo Terminador de Tinte Termosequenasa II de Amersham) y los tintes de transferencia de energía 5CFB-R11, 5CFB-R6G, 5CFB-TMR, 5CFB- ROX (Kit de Secuenciación de Ciclo Terminado ET DYEnamic). Además de los kits de tinte comercialmente disponibles diseñados para el secuenciación de ADN, los tintes, y los ligadores asociados disponibles para marcación de ácido nucleico de vendedores comerciales incluyen sondas moleculares de Invitrogen que también se pueden utilizar.

La capacidad de determinar rápidamente la secuencia de ADN de un fragmento dado o de determinar el tamaño de un fragmento dado ofrece soluciones a muchos problemas médicos y forenses. Por ejemplo, el análisis de ADN puede ayudar en el diagnóstico de cáncer, enfermedades infecciosas (por ejemplo enfermedades virales y enfermedades bacteriales tales como sepsis), y trastornos heredados (tales como la fibrosis cística). El análisis de ADN puede ayudar en la medicina personalizada al permitir que se determine la respuesta a un fármaco de un paciente. De manera similar, el secuenciación del ADN o clasificación por tamaño de fragmentos tiene utilidad en escoger pacientes para enfermedades aparentemente saludables o para incluir o excluir pacientes y voluntarios en ensayos clínicos basados en la caracterización cuidadosa de genes o en marcadores genéticos.

Estudios del genoma humano han revelado, y continúan revelando, la existencia de mutaciones o polimorfismos específicos. Al incrementar la frecuencia, estas mutaciones o polimorfismos están siendo asociadas con enfermedades monogenéticas y poligenéticas. Como resultado, el campo del diagnóstico molecular está creciendo y expandiendo. Las pruebas de diagnóstico molecular utilizan marcadores polimórficos, tales como, micro satélites y STR, y la determinación de mutaciones asociadas con enfermedades neoplásticas y otras. Por ejemplo, la presencia de ciertas infecciones virales, tales como el virus herpes simplex (HSV), el virus citomeglia (CMV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) se han diagnosticado utilizando fragmentos de ADN amplificados y separados. Ciertos tipos de diagnóstico de cáncer también se llevan a cabo utilizando la separación de fragmentos de ADN amplificados. Específicamente, el diagnóstico de linfomas de células B y T cae en esta categoría. Cuando ocurren cánceres, una célula única que tenga una forma simple de un ADN reacomodado crece a una tasa elevada, conduciendo a la predominancia de esa forma del gen. La separación e identificación del gen mutado se puede llevar a cabo utilizando dispositivos convencionales o de microchip. Para una discusión de la aplicación de los métodos de secuenciación y separación y aparatos para diagnósticos moleculares, ver en general, Use of Capillary Electrophoresis for High

Throughput Screening in Biomedical Applications, A Minireview de Bosserhoff et al., en Química Combinatoria y Selección de Alto Rendimiento, 2, emisión 3, páginas 455-66 y Exploiting Sensitive Láser - Induced Fluorescence Detection on Electrophoretic Microchips for Executing Rapid Clinical Diagnostics, de Ferrance et al. En Luminiscencia, 21, emisión 16, página 79- 88.

Con respecto al análisis forense, la capacidad para secuenciar y particularmente clasificar por tamaño fragmentos de ADN tiene el potencial de permitir aprender sospechoso rápidamente (reduciendo así el recidivismo) así como también exonerar individuos falsamente acusados. El genoma humano incluye tramos de ADN compuestos de repeticiones cortas en tándem (STR). A la fecha, cientos de locus STR se han mapeado en el genoma humano. El análisis de tales locus (que incluye mini-STR Y-STR, y secuencias mitocondriales) es una herramienta importante para los estudios forenses. Por ejemplo, el trabajo de casos forenses típicamente involucra la separación y análisis de múltiples locus. Algunas pruebas utilizan 6 pruebas de locus conocida como la Multiplex de Segunda Generación (SGM), junto con amelogenina (marcador que determina el género) y 4 locus adicionales, D35 1358; D19S433; D16S539 y D2S1338. Otros kits comercialmente disponibles amplifican locus STR de 15 tetra nucleótidos y el marcador amelogenina (ver, por ejemplo, kit de amplificación PCR identifiler AmpFISTR). La Oficina de Investigación Federal de los Estados Unidos (FBI) la Red Europea de Instituto de Ciencias Forenses (ENFSI) y la Interpol generalmente reconocen los resultados provenientes de kits que incluyan al menos los 13 locus STR núcleo estandarizados bajo el sistema de índice de ADN combinado (CODIS): CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S82, D8S1179, D13S317, D16S39, D18S51, D21S11; vWA; FGA; TH1; y TPOX. Para una discusión general, ver Budowle, B. et al., CODIS y PCR Based Short Tándem Repeat Loci: Law Enforcement Tools, Segundo Simposio Europeo de Identificación en Flumanos, 1998, página 73-88.

Un locus STR típico tiene menos de 4 pares base de longitud, e incluye unidades repetitivas simples que tienen de dos a 7 pares base de longitud. Los STR pueden definir alelos que son altamente polimórficos debido a las grandes variaciones entre individuos y el número de repeticiones. Por ejemplo, 4 locus en el genoma humano CSF 1PO, TPOX, TH1, y vWA (abreviados CTTv) se caracterizan por un alelo STR que difiere en el número de repeticiones. Dos unidades repetidas se encuentran en estos locus: AATG para TPOX y TH1, y AGAT para CSF 1PO y vWA.

En general, el análisis STR involucra generar un perfil STR de una muestra de ADN, y comparar el perfil STR generado con otros perfiles STR. Generar un perfil STR típicamente involucra amplificar un locus STR que utiliza PCR u otro método de amplificación, entintar o etiquetar los STR dentro de una muestra de ADN, separar los STR etiquetados dentro de la muestra utilizando electroforesis (aplicar un campo eléctrico), y registrar los STR etiquetados utilizando... [Seguir leyendo]

1. Un aparato (1) para procesar una muestra de analito biomolecular, el aparato (1) comprende:

un soporte (2) para sostener un módulo de prueba (55) dicho módulo de prueba (55) comprende una placa transparente que comprende uno o más micro canales (11), en uso al menos un micro canal (11) que está en comunicación fluida con la muestra;

un dispositivo de electroforesis (3) conectado al soporte 2 para suministrar energía para el módulo de prueba (55);

Una fuente de luz (6) para emitir un haz de luz que el uso excita la fluorescencia en la muestra del analito biomolecular; un detector de luz (64); y

una pluralidad de dispositivos ópticos (68, 7, 72) montados dentro del aparato; en donde dicha fuente de luz (6), detector de luz (64) y la pluralidad de dispositivos ópticos (68, 7, 72) se montaron rígidamente a una placa base única (8) para transmitir el haz de luz emitido por la fuente de luz (6) en uso al módulo de prueba (55) y desde el módulo de prueba al detector de luz (64), la placa base (8) que se forma de una pieza única de material y soportada por un m arco (82) que incluye al menos un dispositivo de amortiguamiento (84) para reducir la transmisión de vibración generada por debajo del marco (82) a la placa base (8).

2. El aparato de la reivindicación 1, en donde la placa base (8) Incluye una pluralidad de elementos de aseguramiento para limitar el movimiento de rotación de la pluralidad de dispositivos ópticos (68, 7, 72) sobre la placa base.

3. El aparato de la reivindicación 1, en donde el soporte (2) para soportar el módulo de prueba (55) comprende: un primer miembro que incluye un par de electrodos (1, 12) dispuesto para conectar eléctricamente con las aberturas dispuesta en el módulo de prueba (55): y un segundo miembro que incluye una característica de aseguramiento automatizada (86) para reducir el movimiento lateral del módulo de prueba (55) cuando el módulo de prueba está ubicado entre el primer miembro y el segundo miembro.

4. El aparato de la reivindicación 1, en donde en al menos un canal (11) comprende al menos un canal microfluídico.

5. El aparato de la reivindicación 1, en donde el detector de luz (64) incluye al menos cinco fotomultiplicadores.

6. El aparato de la reivindicación 1, que comprende además un componente de hallazgo de carril para determinar automáticamente una ubicación de al menos un canal (11) dispuesto dentro del módulo de prueba.