Anexinas, derivados de las mismas, y variantes de la anexina-Cys, al igual que usos de diagnóstico y terapéuticos de las mismas.

Variante de anexina compuesta por: un lado convexo que puede enlazarse con al menos un fosfolípido;

y un lado cóncavo, donde al menos un aminoácido en el lado cóncavo ha sido sustituido por un residuo de cisteína, dicho al menos un aminoácido en el lado cóncavo siendo seleccionado de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 1-19, 24, 28, 46-64, 86-89, 118-135, 150, 157-170, 202-219, 245-248, y 280-294 de la SEC ID nº 1.

Anexinas, derivados de las mismas, y variantes de la anexina-Cys, al igual que usos de diagnóstico y terapéuticos de las mismas Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de las anexinas. Más particularmente, se refiere a composiciones y métodos para tratar y diagnosticar una materia administrando compuestos a un objetivo específico usando anexinas, variantes de anexinas, y derivados de las mismas. 10

Los tratamientos genéticos y farmacológicos de enfermedades se basan en la administración de compuestos farmacológicamente activos a células enfermas donde los compuestos actúan preferiblemente intracelularmente. Los tratamientos terapéuticos actuales emplean la administración sistémica de un fármaco, donde el fármaco circula a través del cuerpo entero antes de alcanzar su objetivo deseado. Este método de administración de fármacos 15 produce la dilución sistémica del compuesto. Como resultado, el paciente necesita concentraciones mayores del fármaco para conseguir la eficacia terapéutica favorecedora. Mayores concentraciones de fármaco aumentan de forma natural cualquier efecto secundario tóxico no deseado de los compuestos farmacológicamente activos. Además, mayores concentraciones aumentan generalmente el coste de cualquier medicamento.

Para eludir estos problemas se han diseñado sistemas de administración regional de fármacos que varían desde aplicaciones locales hasta fármacos específicos. La administración regional, no obstante, es frecuentemente insuficiente porque no garantiza la administración a una célula específica. Para actuar eficazmente, muchos fármacos, tal como los quimioterapéuticos y los agentes fotodinámicos, deben entrar en una célula enferma. Se han descrito diferentes sistemas que se pueden utilizar para administrar compuestos a una célula. 25

Péptidos que penetran en la célula o Dominios de transducción proteínica

Los péptidos que penetran en la célula ("CPP") o Dominios de transducción proteínica ("PTD") forman una clase de péptidos capaces de traspasar la membrana plasmática de las células eucariotas, (Lindgren, et al., Trends 30 Pharmacol. Sci. 21:99-103 (2000) ) . Muchos CPP/PTDs son derivados de proteínas de origen vírico más grandes. Los CPP/PTDs también pueden ser diseñados intencionadamente (United States Patent No. 6, 495, 663) . El mecanismo por el que los CPP/PTDs se translocan sobre la membrana no se comprende en su totalidad pero parece ser independiente de la energía. Se ha reconocido el uso potencial de CPP/PTDs en la administración de fármacos y se han publicado ejemplos de conjugados entre CPP/PTDs y carga tal como pequeñas entidades 35 químicas, péptidos, y proteínas (Schwarze, et al., Trends Pharmacol. Sci. 21:45-48 (2000) ; US Patent No. 6, 472, 507) . El inconveniente de los CPP/PTDs es su actividad lítica a altas concentraciones (Scheller, et al., J. Pept. Sci. 5:185-94 (1999) ) . Además, los CPP/PTDs no tienen capacidad específica y no discriminan entre células sanas y enfermas. Por lo tanto, los efectos secundarios tóxicos de los compuestos farmacológicos no se ven disminuidos por su conjugación con los CPP/PTDs. Más bien, los complejos formados por CPP o PTD y un compuesto farmacológico 40 penetrarán tanto en células saludables como en células enfermas. Se ha intentado agregar la funcionalidad de especificidad conjugando CPP/PTDs con anticuerpos específicos para antígenos en tumores. La desventaja de este método, no obstante, es que la función de especificidad del anticuerpo deteriora los CPP/PTDs como resultado de la conjugación (Niesner, et al., Bioconjug Chem. 13:729-36 (2002) ) .

Ligandos para Receptores de membrana plasmática

Se han descrito diferentes vías pinocíticas a través de las cuales las células son capaces de interiorizar compuestos del entorno. Una de las vías pinocíticas comprende la endocitosis mediada por receptor-ligando (Conner, et al., Nature 422:37-44 (2003) ) . Cuando el ligando se enlaza al receptor, el complejo entero se interioriza 50 en pequeñas vesículas intracelulares, que viajarán a través de la célula dependiendo del complejo receptor-ligando implicado. Esta ruta se puede emplear para introducir fármacos en una célula mediante el acoplamiento del fármaco o el vehículo de transporte del fármaco, como liposomas a un ligando específico para receptores de superficie que muestran endocitosis sobre ligamiento. Algunos ejemplos de tales ligandos que inducen internalización son ligandos para el receptor de hFGF (US Patent No. 6, 551, 618) , ligandos para el receptor de asialoglicoproteína (US Patent No. 55 5, 885, 968) , y ligandos para el receptor de transferencia (US Patent No. 6, 511, 967, US Patent No. 5, 154, 924, Qian, et al., Pharmacol. Rev. 54:561-87 (2002) ) . Este tipo de internalización, en la mayoría de los casos, no consigue una función de especificidad óptima para la administración de fármacos. Por otra parte, datos recientes muestran que la internalización a través de la ruta de receptor-ligando puede suprimir la acción farmacológica del fármaco interiorizado (Sato, et al., Pharm. Res. 19:1736-44 (2002) ) . 60

Un compuesto que se puede usar como agente de especificidad y agente de capturado es la anexina A5. Para detectar la anexina A5 ligada a la superficie, ésta ha sido conjugada con compuestos indicadores. En el pasado, los conjugados de anexina A5 se preparaban haciendo reaccionar compuestos indicadores con grupos amino y grupos hidroxilo presentes en la molécula de anexina A5. La anexina A5, no obstante, tiene más de un 65 grupo amino y más de un grupo hidroxilo. Como resultado, el acoplamiento químico con estos grupos funcionales produce mezclas de los diferentes complejos estequiométricos de anexina A5 y el compuesto indicador. El resultado de estos procedimientos de acoplamiento es aleatorio y contiene complejos que no tienen capacidad para enlazarse con aminofosfolípidos porque un conjunto de los aminoácidos reactivos está implicado en la unión fosfolipídica. Estos problemas perjudican la calidad de los conjugados de anexina A5. Para mejorar la calidad, la mezcla del conjugado de anexina A5 ha sido separada por técnicas de purificación adicionales. 5

En un intento para mejorar la anexina A5 para la conjugación, el único grupo sulfhidrilo en la anexina A5, que viene proporcionado por un residuo de cisteína en la posición 315, ha sido acoplado con una única cadena de uroquinasa en un intento de remediar los problemas con los grupos amino e hidroxilo mencionados anteriormente (US Patent No. 5, 632, 986) . Los complejos de anexina A5 y uroquinasas dirigen las uroquinasas a lugares 10 intravasculares para aumentar la actividad fibrinolítica local. El grupo sulfhidrilo, no obstante, se aloja en la molécula y se requiere el despliegue paulatino de la anexina A5 inducido por urea para exponer el grupo sulfhidrilo a la superficie de la proteína. Este procedimiento se utiliza para permitir que la conjugación tenga lugar. No obstante, se requiere la replegación posterior de la anexina A5 para recuperar las capacidades de unión fosfolipídica de la anexina A5. Los procedimientos de replegado no son eficaces al cien por cien y normalmente generan una mezcla 15 inefectiva de moléculas de anexina vinculantes y no vinculantes.

US Patent No. 5, 632, 986 también describe la introducción química de múltiples grupos sulfhidrilo con sulfosuccinimidilo 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato ("SMCC") en la molécula de anexina A5 con fines de conjugación. Este procedimiento genera los mismos problemas experimentados con el procedimiento empleado 20 con los grupos amino e hidroxilo mencionados anteriormente. US Patent No. 5, 632, 986 describe además una variante de anexina A5 con un N-terminal extendido de diez aminoácidos que consta de un residuo de cisteína para permitir la conjugación con un compuesto indicador. Estas variantes tienen 329 aminoácidos, de los cuales dos son cisteínas. Estas variantes pueden plantear el problema de formar puentes disulfuro intramoleculares, y de este modo perjudicar la capacidad de la anexina A5 para enlazarse con fosfolípidos. 25

Los compuestos bioactivos también han sido conjugados con anexina A5 mediante preparaciones recombinantes de quimeras de anexina A5 y los compuestos bioactivos (Tait, et al., Journal of Biological Chemistr y 270:21594-99 (1995) , US Patent No. 5, 632, 986) . US Patent No. 6, 323, 313 describe variantes de la anexina A5 con la extensión de la parte N-terminal de la anexina A5 con un conjunto extra de aminoácidos de los cuales uno es un 30 residuo de cisteína. Los aminoácidos extra con el residuo de cisteína se introducen con el propósito de quelar espontáneamente el radionucleido 99mTc... [Seguir leyendo]

1. Variante de anexina compuesta por: un lado convexo que puede enlazarse con al menos un fosfolípido; y un lado cóncavo, donde al menos un aminoácido en el lado cóncavo ha sido sustituido por un residuo de cisteína, dicho al menos un aminoácido en el lado cóncavo siendo seleccionado de los aminoácidos correspondientes a las posiciones 5 1-19, 24, 28.

4. 64.

8. 89.

11. 135, 150.

15. 170.

20. 219.

24. 248, .

28. 294 de la SEC ID nº 1.

2. Variante de anexina según la reivindicación 1, donde el lado convexo no contiene ningún residuo de cisteína.

3. Variante de anexina según la reivindicación 2, donde la anexina está compuesta por la SEC ID nº 2, que está 10 modificada para contener el residuo de cisteína.

4. Variante de anexina según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la variante de anexina está compuesta además por una o varias sustituciones de aminoácidos, deleciones, o adiciones con sustituciones de aminoácidos, deleciones o adiciones que no afectan esencialmente a la capacidad de la variante de anexina para enlazarse a al 15 menos un fosfolípido.

5. Complejo compuesto por: al menos un compuesto farmacéutico; y una variante de anexina según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y donde el compuesto farmacéutico está químicamente enlazado bien directa o bien indirectamente a través de un portador, un enlazador cruzado, o tanto un portador como un enlazador cruzado, al 20 residuo de cisteína de la variante de anexina.

6. Complejo según la reivindicación 5, donde el enlazador cruzado es seleccionado del grupo consistente en el N-succinimidilo 3- (2-piridilditio) propionato, maleimidoacetato de N-succinimidilo, N-succinimidilo 3-maleimidopropionato, N- succinimidilo 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, piridilo, grupos que contienen 25 maleimida, grupos que contienen halógeno, un isotiocianato, un isocianato, un imidoéster, y un grupo de éster succinimidílico.

7. Complejo según la reivindicación 5 o 6, donde el portador es seleccionado del grupo que consiste en un liposoma, un dendrímero, un polímero, y una combinación de los mismos. 30

8. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde el compuesto farmacéutico es seleccionado del grupo consistente en un compuesto terapéutico, un compuesto de diagnóstico, un compuesto preventivo, un compuesto de investigación, y una combinación de los mismos.

9. Complejo según la reivindicación 8, donde el compuesto terapéutico es seleccionado del grupo que consiste en una toxina, una enzima, un lípido, un carbohidrato, una inmunoglobulina o un fragmento de los mismos, un inmunoconjugado, un compuesto quimioterapéutico, un fotosintetizador, un radionucleido, un agente de inducción de muerte celular, un agente de inhibición de muerte celular, un compuesto fibrinolítico, y una combinación de los mismos. 40

10. Complejo según la reivindicación 8, donde el compuesto de diagnóstico es seleccionado del grupo que consiste en un grupo fluorescente, un agente de contraste, un fotosintetizador, un radionucleido, un agente de ultrasonido, y una combinación de los mismos.

11. Método para elaborar un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, que consta del acoplamiento la variante de anexina al compuesto farmacéutico o por lo menos a un portador del compuesto farmacéutico, bien directa o indirectamente mediante un enlazador cruzado, donde el enlazador cruzado enlaza químicamente el compuesto farmacéutico o el portador a la variante de anexina.

12. Dispositivo para detectar la presencia o ausencia de fosfolípidos, que está compuesto por: un soporte sólido, y al menos una variante de anexina según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la variante de anexina está químicamente enlazada al soporte, bien directa o indirectamente, por el residuo de cisteína; y donde la variante de anexina puede enlazarse a al menos un fosfolípido expresado en la capa externa de una membrana plasmática.

13. Dispositivo según la reivindicación 12, donde el soporte sólido se hace de un material seleccionado del grupo que consiste en metales, sales metálicas, materiales magnéticos, polímeros de monómeros orgánicos, y polímeros de carbohidratos.

14. Método para detectar la presencia o ausencia de células o partículas celulares que expresan fosfolípidos, que 60 comprenden: contactar células con el dispositivo según la reivindicación 12 o 13, y detectar la presencia o ausencia de las células o partículas celulares asociadas al dispositivo.

15. Método según la reivindicación 14, donde el paso de detección es seleccionado del grupo consistente en la tomografía óptica, tomografía SPECT, tomografía PET, tomografía MRI, tomografía TAC, y ultrasonografía. 65

16. Composición o equipo que comprende al menos un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5-10 y, opcionalmente, al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

17. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, donde el compuesto farmacéutico es un compuesto terapéutico, para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad seleccionada entre enfermedades 5 neoplásicas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades autoinmunes, y enfermedades inflamatorias.